保护酶PPO在木薯种质抗螨中的功能初步研究

梁晓卢芙萍卢辉伍春玲曹宪红陈青

（1. 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 农业部热带作物有害生物综合治理重点实验室 海南省热带作物病虫害生物防治工程技术研究中心 海南省热带农业有害生物监测与控制重点实验室，海口 571101；2. 海南大学环境与植物保护学院，海口 570228）

保护酶PPO在木薯种质抗螨中的功能初步研究

梁晓1卢芙萍1卢辉1伍春玲1曹宪红2陈青1

（1. 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 农业部热带作物有害生物综合治理重点实验室 海南省热带作物病虫害生物防治工程技术研究中心 海南省热带农业有害生物监测与控制重点实验室，海口 571101；2. 海南大学环境与植物保护学院，海口 570228）

目前尚不了解保护酶PPO（polyphenol oxidase）在木薯种质抗螨中的作用，为证实PPO的抗螨功能，本研究通过定量PCR和酶学试验手段分析了朱砂叶螨取食抗、感螨木薯种质后，PPO的基因表达量和酶活分别在木薯和朱砂叶螨中的变化情况。结果表明，一方面，朱砂叶螨取食1 d和8 d后，感螨木薯种质BRA900体内MePPO的表达量和PPO总酶活仅分别是为害前的0.99、1.02 倍和1.05、1.03倍，而在抗螨木薯种质C1115体内则分别较为害前提高1.78、1.74倍和1.74、1.72倍，显著高于感螨木薯水平；另一方面，朱砂叶螨取食感螨种质BRA900 1 d和8 d后，保护酶TcPPO的基因表达量和PPO酶活分别是取食前的0.98、0.97倍和0.98、1.10倍，而取食抗螨木薯种质C1115 1 d和8 d后分别降低至为害前的0.52、0.64倍和0.54、0.57倍，显著低于取食感螨木薯水平。上述结果初步证实了保护酶PPO在木薯种质抗螨中的功能。

PPO；朱砂叶螨；木薯种质；抗螨功能

木薯（Manihot esculenta Crantz）亦称树薯，属大戟科木薯属，具有粗生粗长，耐贫瘠、干旱、高产、淀粉含量高等特点［1］，是世界8亿人口的主粮和我国热带地区重要的工业原料、饲料、生物质能源和救荒作物，是仅次于水稻、玉米、甘蔗、甘薯的第五大作物，因其可在山地、坡地等随处种植，“不与人争粮，不与粮争地”，在热带地区农民增收方面发挥着极其重要的作用。近年来木薯在热区的种植面积不断增加，并逐渐成为我国热区农业的支柱产业之一［2］。

朱砂叶螨（Tetranychus cinnabarinus Boisduval）是危害木薯最严重的世界危险性害螨，自2005年以来，该螨在广西、广东、海南、云南、江西等地严重发生与成灾，导致当地木薯减产20%-30%，严重危害时可造成减产50%-70%［3］，已成为严重制约木薯产业可持续发展的主要因子之一。目前，各木薯产区对于朱砂叶螨的防治仍依赖于化学药剂防治，但朱砂叶螨一般于木薯种植后6-8个月暴发成灾，此时的木薯地已封行很难喷施药剂，同时由于其个体小、繁殖能力强、世代短、发育快等特点，比其他害虫容易产生抗药性，在化防过程中因施药技术落后和药剂难以靶标所致农药的有效利用率不足、使用频率与剂量不断加大导致“3R”等问题日趋严重［4］。因此，寻求新的有效地控制朱砂叶螨的策略和方法成为当前木薯产业发展中亟待解决的重要问题。

当前，培育抗螨木薯是防治朱砂叶螨最经济、有效、简便的方法，而抗螨基因的挖掘及其功能研究是采用分子育种手段获得抗螨木薯的关键［5］。害虫为害寄主作物时，造成的组织创伤会在植物体内产生过量的活性氧自由基，影响其正常生长。而害虫取食寄主植物时摄入的次生代谢物质同样会造成虫体内活性氧的累积，不利于取食为害。多酚氧化酶（Polyphenol oxiclase，PPO）是植物抵御植食性昆虫取食的重要保护酶，在抵御植食性昆虫取食中起关键作用［6］。例如，虫害胁迫的茶树叶片PPO活性增强，对昆虫及其诱发的一系列病害有防御作用［7，8］。麦长管蚜为害可诱导抗性小麦叶组织中PPO活性显著升高，而敏感种质中却无显著变化［9］。桃蚜为害可诱导甘蓝体内PPO活性的升高，且随桃蚜为害时间的延长而增加。此外，蚜虫为害可诱导辣椒叶组织内PPO活性显著增强，其酶活性增强及与其同工酶谱的稳定性与辣椒抗蚜性显著相关［10］。然而迄今为止，研究者对PPO在木薯抗螨中的作用尚不知晓。本研究拟通过测定朱砂叶螨取食抗螨木薯种质C1115和感螨木薯种质BRA900后，保护酶PPO基因表达量和活性在木薯和朱砂叶螨中的变化情况，初步研究其在木薯种质抗螨中的功能，旨为将其作为基因资源应用于抗螨木薯种质创制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试木薯种质 抗螨木薯种质C1115，感螨木薯种质BRA900由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所国家木薯种质资源圃提供。

1.1.2 供试朱砂叶螨饲养 参考李迁的方法［11］进行朱砂叶螨的室内饲养。朱砂叶螨为中国热带农业科学院环境与植物保护研究所农业昆虫研究室用健康、生长状况一致的采自田间6个月的面包木薯（感螨品种）叶片连续饲养。饲养条件为：温度28±2℃，相对湿度75 ± 5%光周期14（光）：10（暗）。

1.1.3 器材 Ultraspec 3000紫外可见光分光光度计（Pharmacia Biotech，Ltd.，Cambridge，UK）、MJ Research PTC-100 PCR仪（MJ Research Inc.）组织匀浆机、高速冷冻离心机、Bio-Rad iCycler & iQ Real-Time PCR系统（Bio-Rad，USA）等。

1.1.4 药品 配制缓冲液的相关试剂均为国产分析纯试剂，缓冲液按照分子克隆实验指南（第3版）配制。RNA提取及酶活测定相关试剂均购自Sigma公 司（Sigma-Aldrich Company，USA）。Trizol试 剂盒Invitrogen（Invitrogen Inc. USA），DNaseⅠ 试 剂盒，cDNA合成试剂盒，Master mix，MaximaTMSYBR Green qPCR Master Mix试剂盒均为Fermentas公司产品（Fermentas，Glen Burnie，MD）。

1.2 方法

1.2.1 PPO酶液提取及活性测定 测定木薯叶片的PPO酶活时，将50头朱砂叶螨雌成螨接种于室内种植3个月的木薯顶芽下方的3张叶片上，分别在取食1 d、8 d后将朱砂叶螨从接种叶片上移除。分别取100 mg接种前、为害1 d、8 d后的叶片组织用于酶活分析。测定朱砂叶螨PPO酶活时，将大约200头朱砂叶螨雌成螨接种于采自田间生长6个月的健康木薯叶片上，并按照1.1.2的方法室内饲养，分别取200头取食前，取食抗、感木薯叶片1 d、8 d后的成螨用于酶活分析。上述各个木薯或朱砂叶螨处理均设置3个重复。PPO活性测定参照参考Lu［12］的方法。在小试管中依次加入0.02 mol/L邻苯二酚溶液0.4 mL，0.05 mol/L pH6.8磷酸缓冲液0.4 mL，酶液0.1mL作为测定管；另外取一个小试管，只加前2种溶液，不用加酶液作为对照管。在30℃下反应2 min，398 nm波长下测OD值。由于在本研究中我们着重关注抗、感螨木薯在受朱砂叶螨为害时，PPO酶活提升以清除活性氧的能力是否存在显著差别，而通过比较为害前后比活力倍数变化的方法更能够凸显出这种差异［12］。

1.2.2 保护酶基因PPO表达量的定量PCR测定 木薯叶片和朱砂叶螨的RNA样品采集方法与酶活分析相同。木薯和朱砂叶螨总RNA的提取参照Trizol RNA提取试剂盒进行。总RNA经gDNA Eraser（TaKaRa Biochemicals，Dalian，China）处理去除基因组DNA后，取1.0 μg用于cDNA的合成。cDNA样品经nuclear-free 水10倍稀释后作为荧光定量PCR的模板，分别以木薯和朱砂叶螨各自的actin基因为管家基因，相关基因的引物信息如表1［13］所示。PCR反应条件为：95℃预温育1 min后，以40个循环完成如下程序：95℃变性15 s，60℃ 退火15 s，72℃ 延伸20 s。根据Pfaffl［14］的2-ΔΔCt方法计算处理前后PPO基因的相对表达量的变化倍数，以反映木薯或朱砂叶螨应对氧化损伤的转录水平的差异。1.2.3 数据分析 采用SPSS软件进行数据分析，显著性差异分析采用Student’s t-test，所有数据均为3个生物学重复的平均值±标准（x-±s），显著性检测水平为P＜0.05。

表1 木薯、朱砂叶螨保护酶基因PPO表达量qPCR测定引物信息

2 结果

2.1 朱砂叶螨为害前后抗、感螨木薯种质叶组织中MePPO基因表达量差异分析

从图1可以看出，朱砂叶螨为害前后抗、感木薯种质叶组织中MePPO基因表达量变化存在显著差异。朱砂叶螨取食1 d和8 d后，感螨木薯种质BRA900叶组织中MePPO基因表达量仅分别是为害前的0.99和1.02倍，而抗螨木薯种质C1115叶组织中MePPO的基因表达量分别是为害前的1.78 和1.74倍，表明抗螨木薯种质C1115通过显著提高保护酶MePPO的转录水平启动活性氧清除机制，从而较感螨种质BRA900具有更强的抗螨害能力。

图1 朱砂叶螨为害前后抗、感螨木薯保护酶MePPO基因表达量变化

2.2 朱砂叶螨为害前后抗、感螨木薯种质叶组织中PPO酶活力差异分析

从图2可以看出，朱砂叶螨为害前后抗、感螨木薯种质叶组织中PPO酶活力存在显著差异。朱砂叶螨取食1 d和8 d后，感螨木薯种质BRA900叶组织中PPO酶活力较为害前提高1.05和1.03倍，而抗螨木薯种质C1115叶组织中PPO酶活力较为害前分别提高1.74和1.72倍，表明木薯叶片中PPO酶活力的变化趋势与基因水平相一致，抗螨木薯种质C1115通过显著提高保护酶PPO的活力启动活性氧清除机制，从而较感螨种质BRA900具有更强的抗螨害能力。

图2 朱砂叶螨为害前后抗、感木薯保护酶PPO活性变化

2.3 取食抗、感螨木薯种质前后朱砂叶螨体内TcPPO基因表达差异分析

从图3可以看出，取食抗、感螨木薯种质前后朱砂叶螨体内TcPPO基因表达量变化存在显著差异。朱砂叶螨取食感螨木薯种质BRA900 1d，8d后体内保护酶TcPPO的表达量分别是取食前的0.98和0.97倍，而取食抗螨木薯种质C1115 1 d，8 d后TcPPO的表达量降低至取食前的0.52和0.64倍。上述结果表明与取食感螨种质BRA900相比，取食抗螨木薯种质C1115后，朱砂叶螨体内的TcPPO表达受到了显著抑制，不利于其为害抗螨种质C1115。

图3 取食抗、感木薯种质前后朱砂叶螨体内TcPPO基因表达量变化

2.4 取食抗、感螨木薯种质前后朱砂叶螨体内PPO酶活力差异分析

从图4可以看出，取食抗、感螨木薯种质前后朱砂叶螨体内PPO酶活力变化存在显著差异。朱砂叶螨取食感螨木薯种质BRA900 1 d，8 d后体内PPO酶活力分别是为害前的0.98和1.10倍，而取食抗螨木薯种质C1115 1 d，8 d后PPO酶活力降低至为害前的0.54和0.57倍。上述结果表明朱砂叶螨取食抗、感螨木薯种质后酶活的变化趋势与基因水平一致，取食抗螨种质C1115后PPO酶活力被显著抑制削弱了朱砂叶螨修复自身氧化损伤能力，不利于其为害抗螨种质C1115。

图4 取食抗、感木薯种质前后朱砂叶螨体内PPO酶活差异

3 讨论

保护酶活性增强能够有效减轻活性氧导致的细胞氧化损伤［15］。多酚氧化酶PPO作为重要的保护酶，不仅可通过清除活性氧而抵御害虫对寄主植物的侵害，还可作为次生代谢途径中的重要酶，调控和影响寄主植物次生代谢物质的产生。例如，PPO能把植物组织中的一些酚类物质氧化成毒性物质［16，17］，从而参与植物防御害虫的反应，增强植物的抗虫性。测定分析寄主植物和害虫互作时PPO基因表达量和酶活力的变化情况将有助于研究PPO在作物抗虫中的功能。

PPO参与植物的防御反应，其基因表达和活性显著升高可有效提高植物抗虫性水平［18-20］。虫害会诱导植物体内PPO基因的过量表达，例如马铃薯和番茄经虫害诱导后，PPO基因可高水平表达，且可受茉莉酮酸酯（JA）的进一步诱导［18］。Franzen［19］等研究表明，蚜虫取食抗性小麦15 d后，包括PPO在内的5个氧化酶基因显著表达，而在敏感小麦种质中却没有表达。虫害同样会导致PPO酶活性的变化。还有研究表明［7-9］，茶树、甘蓝和小麦体内PPO活性的显著升高可以形成对茶尺蠖、桃蚜和麦长管蚜的抗性。本研究获得的结果与前人相似，抗螨木薯种质C1115被朱砂叶螨为害1 d、8 d后，MePPO基因表达量较为害前提高幅度较大，并且显著高于感螨种质BRA900受害后的变化水平，而为害1 d和8 d的PPO基因表达量或酶活无显著差异，表明抗螨木薯PPO对螨害的响应快，并且能够长时间维持在较高水平。以上这些结果表明对于抗螨种质C1115，保护酶PPO能够有效缓解朱砂叶螨取食后造成的氧化损伤，从而增强其抗虫性。

害虫取食寄主植物时，害虫体内保护酶PPO被抑制也是形成寄主植物抗虫性的重要因素［21-22］。Krishnan等［21］发现棉贪夜蛾取食番茄后体内PPO的活性显著高于取食半人工饲料，并推断抗氧化酶活性增强是形成其对番茄寄主适应性的主要因素。对森林天幕毒蛾和白斑毒蛾的研究发现［22］，寄主植物的单宁酸能够显著抑制中肠抗坏血酸PPO的活性从而形成较强的抗虫能力。本研究中，朱砂叶螨取食抗螨木薯种质C1115 1 d和8 d后，体内PPO的表达量和活性与取食前相比降低幅度较大，并且显著低于取食感螨木薯种质BRA900的对应水平，而取食1 d和8 d的害螨体内PPO基因表达量或酶活无显著差异，表明朱砂叶螨取食抗螨木薯后体内PPO受到长时间持续抑制。以上结果说明抗螨木薯抑制了朱砂叶螨PPO修复自身氧化损伤的功能，不利于被朱砂叶螨为害形成适宜寄主；相反，朱砂叶螨取食感螨木薯种质BRA900后，体内PPO的表达量和活性与取食前相比显著升高，说明朱砂叶螨能够正常启动活性氧清除机制以应对摄入的次生代谢物质造成的氧化损伤，从而易于在感螨木薯上为害。

PPO在木薯和朱砂叶螨中均起到清除活性氧减少氧化损伤的作用。抗螨木薯一方面通过提高自身PPO的活性来抵御螨害造成的植株氧化损伤，另一方面朱砂叶螨取食抗螨木薯后自身的PPO受到了显著抑制，不利于其继续取食为害。因此，PPO在木薯抗螨中的作用是体现在寄主-害螨两个层面的，是两者互作的结果。本研究初步证实保护酶PPO在木薯抗螨中的功能，具有作为有效基因资源应用于抗螨木薯分子育种的应用潜力，但其功能有待进一步研究与验证。

4 结论

本研究发现受朱砂叶螨为害后，抗螨木薯种质C1115体内MePPO的基因表达量和PPO酶活较感螨木薯种质BRA900显著提高，而取食抗螨木薯种质C1115后朱砂叶螨体内TcPPO的基因表达量和PPO酶活较取食感螨木薯种质BRA900显著被抑制。

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（责任编辑 狄艳红）

Preliminary Study on the Function of Polyphenol Oxidase in Cassava Resistance to Mite

LIANG Xiao1LU Fu-ping1LU Hui1WU Chun-ling1CAO Xian-hong2CHEN Qing1
（1. Environment and Plant Protection Institute，China Academy of Tropical Agricultural Sciences/Laboratory of Pests Comprehensive Governance for Tropical Crops，Ministry of Agriculture/Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests/Hainan Engineering Research Center for Biological Control of Tropical Crops Diseases and Insect Pests，Haikou 571101；2. College of Environment and Plant Protection，Hainan University，Haikou 570228）

So far，the function of polyphenol oxidase（PPO）in cassava resistance to mite has not been understood clearly. In order to validate this function，we used quantitative real-time PCR（qPCR）and enzymatic assay to determine the changes of expression and activities of PPO in either cassava or Tetranychus cinnabarinus after the mite-resistant and mite-susceptible cassava cultivars were damaged by T. cinnabarinus. The results showed that，in one hand，compared to those in the same leaves before damaged，the transcriptions of MePPO and total activities of PPO only increased to 0.99-，1.02-fold and 1.05-，1.03-fold while the mite-susceptible cassava cultivar BRA900 was damaged by T. cinnabarinus for 1 d and 8 d，respectively. However，the corresponding values in 1 d- and 8 d-damaged leaves of mite-resistant cassava C1115 increased to 1.78-，1.74-fold and 1.74-，1.72-fold，respectively，thus significantly higher than those of mite-susceptible cassava. In the other hand，compared with those before feeding，the expressions of TcPPO and activities of PPO in T. cinnabarinus were 0.98-，0.97-fold and 0.98-，1.10-fold，respectively after feeding on BRA900 for 1 d and 8 d；while the corresponding values in T. cinnabarinus feeding on C1115 decreased to 0.52-，0.64-fold and 0.54-，0.57-fold，respectively. This study preliminarily validated the function of PPO in cassava resistance to T. cinnabarinus.

polyphenol oxidase；Tetranychus cinnabarinus；cassava；resistance to mite

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.04.018

2016-08-21

国家木薯产业技术体系害虫防控岗位科学家专项（CAR S-12-hncq）（CARS-12-hncq）

梁晓，男，博士，助理研究员，研究方向：生物化学与分子生物学及作物抗虫性；E-mail：liangxiaozju@126.com

陈青，男，博士，研究员，研究方向：生物化学与分子生物学及作物抗虫性；E-mail：chqingztq@163.com