光电子响应微生物的筛选鉴定及生长代谢特征研究

向沙刘明学，张格格罗浪魏红福董发勤

（1. 西南科技大学生命科学与工程学院，绵阳621010；2. 固体废物处理与资源化教育部重点实验室，绵阳621010）

光电子响应微生物的筛选鉴定及生长代谢特征研究

向沙1刘明学1，2张格格1罗浪1魏红福2董发勤2

（1. 西南科技大学生命科学与工程学院，绵阳621010；2. 固体废物处理与资源化教育部重点实验室，绵阳621010）

筛选可良好响应半导体光电子的微生物菌株，在矿物与微生物交互作用研究中应用前景广阔。从某铀尾矿土壤中，利用含有半导体材料TiN营养成分1/2、1/4、1/8、1/10、1/50、1/100和1/1 000的培养基在光照条件下筛选出光电子响应的菌株；通过形态特征、生理生化和分子系统学对菌株进行鉴定，并用紫外-可见吸收光谱和三维荧光光谱测试分析该菌株在光电子作用下生长情况以及蛋白质、腐殖酸等代谢产物的变化。结果显示，从土壤中筛选出一株对光电子具有较强响应效果的菌株Y-5，经鉴定为粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）。该菌株在1/10底物浓度中由于营养丰富光电子作用并不明显，在1/50，1/100较低底物浓度中营养贫乏，光电子作用加速了该菌生长速率，代谢产物蛋白质、腐殖酸也相应增加。从土壤筛选得到的光电子响应微生物菌株粪产碱杆菌，光电子能促进其生长代谢。该方法在定向筛选光电子响应的菌株方面具有一定的可行性。

光电子；粪产碱杆菌；生长代谢；蛋白质；腐殖酸

长期以来，人们将微生物按能量代谢的途径分为两大类：光能营养微生物和化能营养微生物，并且认为非光合型的微生物只能利用无机物、无机成因或者生物成因的有机物来获得能量，不能直接利用太阳光能。但是随着矿物和微生物交互作用研究的发展，发现了地表广泛存在的半导体矿物吸收太阳光能后分离的光电子-空穴对，亦可对微生物产生作用。例如，微生物可通过细胞外膜上的一些分子（如血红素）与铁锰矿物晶体结构中的变价元素Fe、Mn进行价电子交换以此获取能量［1-4］；半导体矿物光催化作用可以显著降低红壤微生物群落多样性，改变红壤微生物群落结构［5］。天然闪锌矿产生的光电子促进嗜酸性氧化亚铁硫杆菌生长［6］；一定范围内的光电子能量可促进粪产碱杆菌生长［7］；半导体矿物CdS光催化产生的光电子能够作用于从异养产碱杆菌菌体中提取的NAD辅酶，使其还原为NADH［8］。这意味着半导体矿物光电子可以作为部分微生物生长代谢所需的重要能量来源，揭示了一种在自然界中可能广泛存在的非光合微生物利用太阳能的新途径［1］。自然界土壤中广泛存在的还原性物质（腐殖酸、抗坏血酸、还原态硫等）［9-12］，能够捕获半导体产生光电子的空穴，并担当电子穿梭体参与微生物在地表过程中的物质循环与能量代谢［13-15］。综上所述，半导体矿物光生电子作为土壤微生物的外源电子来源之一，理应对土壤微生物的生长代谢行为产生一定的影响［1］。

半导体材料纳米TiN作为催化及材料领域的一类重要的半导体化合物［16，17］，与TiO2相比，氮掺杂晶格结构中，电荷密度分布改变形成缺陷或改变晶格类型，其能带结构改变，光催化性能改善［18-20］，可见光响应能力强，是一种优良的可见光催化剂［14，15］，所以研究采用TiN作为提供光电子的半导体材料。本研究利用半导体材料纳米TiN提供光电子从某铀尾矿区土壤里直接筛选出能够较强响应半导体矿物光电子的微生物，探讨该微生物响应光电子过程中代谢产物的变化规律，旨为阐明微生物与矿物光电子相互作用微观机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂 土壤样品采集于某铀尾矿区。TiN悬液：称取0.003 g TiN将其倒入600 mL的超纯水，超声振荡30 min使其均匀分散后，121℃灭菌20 min，保存备用。培养基：酵母粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂20.0 g，抗坏血酸12 g（空穴捕获剂），蒸馏水1 000 mL，pH7.0-7.2（除NaCl以外的成分按1∶2、1∶4等比例稀释，配制相应的1/2、1/4培养基）。马斯亮蓝G-250染料试剂：称取10 mg考马斯亮蓝G-250，加入95%乙醇5 mL和85%磷酸10 mL，定容至100 mL。

1.2 方法

1.2.1 钠灯照射TiN材料光电子性能分析 取5 mg/L的50 mL TiN悬液混匀至石英电解池，插入钛片工作电极、饱和甘汞参比电极、铂丝对电极，在钠灯光照100 s、无光照100 s、光照200 s和无光照200 s交替作用条件下，设置电压0 V测定样品电流。

1.2.2 光电子响应微生物的筛选 分别取上述土壤样品5 g，加入100 mL浓度为5 mg/L TiN的1/2液体培养基，放在钠灯照射下的振荡培养箱培养2-d（条件：转速120 r/min，温度30℃），取1 mL培养液至新鲜的浓度为5 mg/L TiN的1/4液体培养基，钠灯照射下培养2-3 d。取0.5 mL涂布在1/8固体培养基（TiN浓度为5 mg/L），钠灯照射下培养2-3 d。接种到1/50固体培养基（TiN浓度为5 mg/L）反复划线分离纯化，得到较强响应光电子的Y-5菌株，接种在1/100和1/1 000固体培养基平板（TiN浓度分别为5 mg/L和0 mg/L），并观察菌落生长状况。

1.2.3 菌株Y-5的鉴定

1.2.3.1 形态学鉴定 将筛选到的菌株划线接种于固体培养基平板上，30℃培养2-3 d，观察菌落形态；取稳定期菌夜涂布至盖玻片，自然风干，用2.5%戊二醛固定8 h后倒掉戊二醛，分别用30%、50%、70%、90%和100%乙醇梯度洗脱（每次15-20 min），自然风干后电子显微镜扫描菌体形态。参照《伯杰氏细菌鉴定手册（第9版）》［21］与《常见细菌系统鉴定手册》［22］对获得的菌株进行革兰氏染色、氧化酶等生理生化实验。确定菌株类型。

1.2.3.2 系统发育学分析 用生工生物工程股份有限公司提供的Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取出该菌株的DNA，以7F 1540R和27F 1492R为引物，利用PCR技术扩增出16S r DNA区段，并将扩增片段用1%的琼脂糖凝胶进行电泳［23］，纯化PCR产物在上海生工生物工程有限公司测序，通过Blast 比对分析所得序列与GenBank 数据库中已有的细菌 16S rRNA 序列的相似性，运用MEGA 5.1 软件构建系统发育树。

1.2.4 菌株Y-5生长对光电子的响应 分别配制5 mg/L TiN的1/10、1/50、1/100液体培养基（按照每个浓度设置光照组和锡箔纸包裹的黑暗组即无光电子组），然后加入稳定期的菌种1 mL，放在钠灯照射下的振荡培养箱培养（条件：转速180 r/min，温度30℃），利用紫外-可见分光光度计在0 h、6 h、10 h、12 h、16 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h时段取菌液3 mL于波长600 nm下测OD值，每组处理设置3个重复。收集培养72 h的菌体，生理盐水清洗菌体后，置于0.2 mol/L NaOH中沸水浴10 min，得到微生物蛋白液，取待测蛋白液用0.9%生理盐水按一定比例稀释至2.4 mL，加入0.6 mL G-250（100 mg/L）于比色管中混合摇匀。使用紫外分光光度计于峰位595 nm，以生理盐水作参比，测定吸光度，通过制作标准曲线，计算总蛋白的量［6，24，25］。

建设项目压覆矿产资源的评估还应进行可否压覆的评价。评估的重点，是以被压覆资源近几年平均价格水平上的经济价值，与该工程项目产生的社会、经济、生态效益进行对比，评估压覆矿产资源的利弊，并给出建设项目是否值得压覆的建议，为行政主管部门批复项目工程提供依据。

1.2.5 菌株Y-5代谢对光电子响应 按照1.2.4方法和条件将培养到稳定期的菌液在4℃、10 000 r/min条件下冷冻离心，收集上清液，利用F-7000荧光光度计进行三维荧光分析。仪器参数：激发和发射波长是从200 nm开始扫描，到800 nm结束；扫描速度为12 000 nm/min；狭缝10 nm，步径10 nm，PMT电压为700 V［26］。

2 结果

2.1 钠灯照射TiN材料光电子性能分析

为验证半导体材料TiN产生光电子性能，测定了TiN在钠灯照射下恒电位时间-电流（I-t）曲线。结果（图1）表明在有光照时TiN悬液电流值大约在1.0 uA，在无光照时电流值大约在0 uA，光照时段电流大于无光照时段电流。说明该浓度TiN，在钠灯下可以产生一定量的光电子。

图1 TiN恒电位I-t曲线

2.2 光电子响应微生物的筛选

经初步富集、筛选分离得到光电子响应微生物Y-5菌株。如图2所示，菌株在5 mg/L TiN的1/100固体培养基上出现生长现象，在无TiN的1/100固体培养基和5 mg/L TiN的1/1 000固体培养基上无生长现象，光电子对该菌的生长产生了一定的促进作用。

图2 光电子响应微生物筛选结果

2.3 菌株的鉴定

2.3.1 菌株的形态学观察 在完全营养成分的固体培养基上，Y-5菌株颜色为半透明到不透明，形态为扁平或略凸起，光滑（有时为模糊或粗糙）和边缘完整，大多数菌株可蔓延成不规则边缘（图3，图4）。通过扫描电镜发现菌株大小约为0.7-2 μm，为杆状。菌株Y-5常规生理生化特征分析结果见表1，结果表明菌株Y-5为革兰氏阴性细菌，不能利用糖类物质，可以利用柠檬酸盐，在肉汤培养基中pH值上升到8.6左右，与产碱杆菌属粪产碱杆菌相似。

图3 Y-5菌落形态

图4 Y-5 SEM图像

2.3.2 系统发育学分析 将菌株Y-5的16S rRNA序列（扩增长度为1 415 bp），通过 GenBank 进行序列分析和同源性比对。结果（图5）表明，菌株Y-5序列与粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）的16S rRNA 序列同源性为98%。

2.4 粪产碱杆菌生长对光电子的响应

为了突出不同条件下实验效果差别，给细菌一定的生长压力，在生长代谢实验中分别采用稀释10倍、50倍和100倍的培养基培养。如图6所示，分别为菌株Y-5在5 mg/L TiN的1/10、1/50和1/100液体培养基的生长曲线，在接种培养初期（即最初约5 h），细菌生长处于迟缓期，光照实验组与黑暗对照组无差别；5 h后，开始进入对数生长期，细菌大量繁殖，细胞浓度大幅增加。在1/10培养基中，对数期光照实验组细胞浓度与黑暗对照组几乎无差别，在1/50和1/100培养基中生长速率和生长数量均大于相应浓度的黑暗对照组，表明光催化提高了细菌生长速率和数量。随后细菌生长进入衰亡期，在1/10培养基中，光照实验组衰亡速率与黑暗对照组衰亡速率差别不明显；在1/50和1/100培养基中光照实验组衰亡速率明显小于黑暗对照组，表明光催化延长了细菌的衰亡时间。定量蛋白测试结果（图7）显示1/10、1/50和1/100培养基有光电子菌体总蛋白含量大于无光电子对照组综上所述1/50和1/100液体培养基中TiN产生的光电子促进了菌株Y-5生长。

表1 菌株Y-5的生理生化特征

2.5 粪产碱杆菌光电子响应中代谢产物的变化

通过三维荧光技术测定有无光电子作用下Y-5菌株的代谢产物变化。如图8所示，荧光图谱主要在激发波长200-400 nm和发射波长200-500 nm范围内，该区域主要在蛋白质荧光峰（激发波长位于260-290 nm，发射波长发射波长位于340-380 nm）和腐殖酸荧光峰（激发波长位于320-390 nm，发射波长位于400-480 nm）。读取该区域内蛋白质荧光峰值（1/10、1/50和1/100培养基光照组和黑暗组分别是4 029和3 987、2 689和2 574、1 241和1 130）和腐殖酸荧光峰值（1/10、1/50和1/100培养基光照组和黑暗组分别是2 792和2 779、893和841、453和402）表明Y-5菌株在5 mg/L TiN的1/10、1/50和1/100培养基中光照实验组的蛋白质荧光峰和腐殖酸荧光峰变化较明显。

图5 Y-5菌株和相似属的一些种基于16S rDNA序列构建的系统发育树

图6 Y-5菌株生长曲线图

图7 Y-5菌株与5 mg/L TiN的1/10、1/50、1/100培养基作用后总蛋白测定结果

分析蛋白质和腐殖酸结果如图9所示，Y-5菌株在1/10培养基中的蛋白质和腐殖酸荧光峰光照实验组与黑暗对照组差别较小，在1/50和1/100培养基中蛋白质和腐殖酸荧光峰光照实验组与黑暗对照组差别较大，即在该条件下光照实验组蛋白质和腐殖酸含量大于黑暗对照组。说明在1/50和1/100培养基中光电子作用下Y-5菌株代谢加快。结合生长曲线分析，Y-5菌株在低浓度底物下利用光电子效率更高。

图8 三维荧光图谱

图9 Y-5菌株与5 mg/L TiN的1/10、1/50、1/100培养基作用后蛋白质（A）和腐殖酸（B）的荧光强度变化分析图

3 讨论

土壤里的微生物是土壤生态系统结构和维持生态系统稳定性的重要构成［27］，不仅可以代谢土壤中的动植物残体、调节土壤有机质、土壤结构形成［28］，而且与无机矿物的交互作用影响着地球表层物质循环与环境演化，包括矿物的形成与演化、养分循环与污染物的环境行为等［29-32］。随着矿物与微生物交互作用研究领域的发展，微生物与矿物之间电子转移和能量流动逐渐受到关注。近年来，国内外关于这方面研究也取得一些进展，不仅发现一些微生物可以利用光电子为自身提供能量［1］，还探索了微生物利用光电子途径受到光波长（光子能量）与光强（光子数量）两方面的因素调控、氧化亚铁硫杆菌利用光电子的机理以及利用效率等［2，33］。

大量研究表明［1，34］，半导体光电子能够延长铁细菌的电子传递链，作为新陈代谢的能量，实现光能-电能-化学能-生物能的转换，但转换效率远远低于植物转换效率的10%；在外加电压下光电子作用使氧化亚铁硫杆菌细胞浓度由2.5×105/mL上升到到3.25×106/mL，增加12倍。曾翠萍等［35］加偏压证实外来电流可促进粪产碱杆菌菌体在电极表面上的生长和附着；鲁安怀等［2］利用光燃料电子双室装置体系模拟日光下矿物光电子证实光电子降低土壤里微生物群落多样性，影响微生物群落结构。本研究利用半导体材料光生电子与土壤里微生物直接作用，筛选获得Y-5菌株，经形态生理生化系统发育学鉴定为粪产碱杆菌。底物浓度的限制改变了微生物对底物利用效率［36］，该菌在1/10底物浓度中光电子作用不明显，在1/50，1/100较低底物浓度中光电子作用使总蛋白含量增加，菌体生长加速。说明粪产碱杆菌是土壤微生物中光电子响应较强的微生物，能够利用光电子作为自身能量来源。

生物地球化学的观点认为，腐殖质能够担当电子穿梭体的角色，参与微生物在地表过程中的物质循环与能量代谢［37-40］；微生物能够分泌腐殖质物质进行电子穿梭，参与能量代谢［41］；余萍等［7］通过模拟天然半导体矿物所产生的光生电子证实，该模拟光电子作用下，粪产碱杆菌形成了大量具有电化学活性的代谢产物。本研究结果表明，光电子作用下粪产碱杆菌代谢产物蛋白质和腐殖酸增加较多，说明光电子作用下该菌生长代谢加快，增加的腐殖质可能参与电子传递。在后续的研究中将利用代谢组学手段对代谢产物进行分析，结合蛋白组学和转录组学［42］研究半导体矿物光电子在矿物和粪产碱杆菌活动界面上的传递过程与其生长代谢的微观机制［43］。

4 结论

本研究主要利用含半导体材料TiN的1/2、1/4、1/8、1/10、1/50和1/100培养基分离纯化得到一株对光电子较强响应的Y-5菌株，依据形态特征、生理生化和16S rRNA序列系统发育学分析，鉴定其为产碱杆菌属的粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）。菌株在不同浓度底物条件下，生长曲线不同；其不仅能够在5 mg/LTiN光催化下的1/50，1/100低营养成分的培养基中稳定生长，且生长速率和代谢速率也相应的加快，表明该菌株具有响应光电子的能力，是一株“光电能微生物”。同时表明该筛选光电子响应微生物的方法具有可行性，可应用于进一步发现和丰富“光电能微生物”资源方面的研究。

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（责任编辑 狄艳红）

Screening of Photoelectron-response Microbes as well as Their Growth and Metabolism

XIANG Sha1LIU Ming-xue1，2ZHANG Ge-ge1LUO Lang1WEI Hong-fu2DONG Fa-qin2
（1. Life Science and Engineering College，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010；2. Key Laboratory of Waste Solid Treatment and Resource Recycle of Ministry of Education，Mianyang 621010）

Screening microbial strains that have promising response to semiconductor photoelectron brings broad application prospects in the study of interaction between minerals and microorganisms. Using the uranium tailing area soil，the microbial strains with photoelectronresponse were screened in the media of containing 1/2，1/4，1/8，1/10，1/50，1/100，and 1/1 000 semiconductor material TiN under illumination condition. Then the strain was identified through its morphological，physiological and biochemical characteristics，and the molecular phylogeny. Ultraviolet-visible absorption spectra and three-dimensional fluorescence spectra were used to analyze the growth of the strain and the changes of protein，humic acid，and other metabolites. The strain Y-5 screened from soil was identified to be Alcaligenes faecalis，which had strong response to photoelectron of TiN. The optoelectronic effect was not obvious due to rich nutrient in the 1/10 substrate concentration；but in 1/50 and 1/100 low substrate concentration，the growth rate was accelerated by photoelectron due to poor nutrient，and the protein and humic acid increased correspondingly. A photoelectron-response microbial strain A. faecalis was screened from an uranium tailing area soil，and the photoelectron promoted its growth and metabolism. This method demonstrated certain feasibility in screening the photoelectron-response.

photoelectron；Alcaligenes faecalis；growth and metabolism；protein；humic acid

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.04.027

2016-10-31

国家重点基础研究发展计划（“973”）项目（2014CB846003），国家自然科学基金项目（41272371）

向沙，女，硕士研究生，研究方向：环境微生物；E-mail：583567642@qq.com

刘明学，男，教授，研究方向：环境微生物；E-mail：dragonlmx@126.com