组织切片抗酸染色法的改良和应用体会

陈世梁，吴文川，卢志承

(海南省人民医院病理科，海南 海口 570311)

·经验交流·

组织切片抗酸染色法的改良和应用体会

陈世梁，吴文川，卢志承

(海南省人民医院病理科，海南 海口 570311)

目的 探讨在组织切片病理诊断中抗酸染色方法的改良和应用，提高结核病的诊断率。方法选取病理诊断为肺结核的患者60例，每例选出病变蜡块1块，每块蜡块切片2张，1张用传统Ziehl-Neelsen抗酸染色法染色，另1张用改良抗酸染色法染色，比较两种染色方法的阳性率和染色效果。结果60例患者中，应用传统抗酸染色方法检出抗酸杆菌28例，阳性率为46.67%，应用改良抗酸染色方法检出抗酸杆菌49例，阳性率为81.67%。两种方法检测结果阳性率比较差异有显著统计学意义(P<0.01)；与传统抗酸染色方法相比，改良抗酸染色方法检出的结核杆菌细菌量多，菌体粗且着色深。结论改良的抗酸染色法提高了结核杆菌的检出率，值得临床推广应用。

抗酸染色；组织切片；结核分枝杆菌

近年来，随着免疫组化检测技术和分子病理技术的广泛应用，很多特殊染色方法逐渐被免疫组化及分子病理学诊断技术取代。但是，由于结核杆菌着色的特异性，利用抗酸染色在病理组织切片检测出结核杆菌是诊断结核病的金指标，因此抗酸染色在日常病理工作中仍然发挥着不可替代的作用。Ziehl-Neelsen抗酸染色法[1]是检测结核杆菌的传统经典的方法，但该法存在操作繁琐费时、阳性率较低等弊端。为此，笔者在实践工作中加以改良，取得了比较满意的效果，现介绍如下：

1 材料与方法

1.1 材料 选取海南省人民医院病理科2012-2015年经病理诊断为肺结核的患者60例，每例选出病变蜡块1块。

1.2 方法 60例蜡块每例分别切片2张，分成传统组和改良组，分别进行传统抗酸染色和改良抗酸染色。

1.2.1 传统Ziehl-Neelsen抗酸染色法[1](1)常规石蜡切片3～5µm厚；(2)常规二甲苯脱蜡至水；(3)苯酚碱性品红液染色1 h；(4)自来水洗1 min；(5)0.5%盐酸乙醇分化数秒钟；(6)水洗1 min；(7)Mayer苏木素复染2 min；(8)流水冲洗10 min；(9)常规无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.2.2 改良抗酸染色法 (1)石蜡切片厚度5～ 6µm。(2)切片用松节油和97号汽油按体积比1:1的混合液脱蜡2次，每次约5～10 min；用吸水纸将抹去切片周围液体至切片稍湿润；流水漂洗1 min。(3)0.5%的高碘酸溶液氧化5～8 min，流水冲洗2 min，再用蒸馏水浸洗2次，每次30 s。(4)0.2%TritonX-100液处理10 min。(5)苯酚碱性品红液在室温下染色20～30 min。 (6)流水洗去多余染液。(7)20%硫酸水溶液分化30 s～ 1 min。(8)流水冲洗5 min。(9)Mayer苏木素浅染胞核。(10)流水冲洗10 min。(11)置于60℃烘箱内烘干，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.3 统计学方法 两种方法结果的比较采用SPSS18.0进行χ2检验，以P<0.01为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两种抗酸染色法的抗酸杆菌检测结果比较 60例患者中，应用传统抗酸染色方法检出抗酸杆菌28例，阳性率为46.67%，应用改良抗酸染色方法检出抗酸杆菌49例，阳性率为81.67%。两种方法检测结果比较，差异有显著统计学意义(χ2=15.983，P<0.01)。

2.2 两种抗酸染色法的染色效果比较 传统抗酸染色方法中的结核杆菌呈红色，菌体呈细杆状，背景着色较深(图1)。改良抗酸染色方法中的阳性结核杆菌量增多，呈亮红色，菌体呈杆状，色泽鲜明，菌体和背景着色适度，对比明显而清晰(图2)。

图1 Ziehl-Neelsen抗酸染色法(×100)

图2 改良抗酸染色法(×100)

3 讨论

在病理诊断工作中进行抗酸染色的目的是在组织切片中检出抗酸杆菌进而确诊结核病。抗酸杆菌属分枝杆菌，其菌体细胞壁上含有不等量的脂质，主要是磷脂、脂肪酸和蜡质三种成分[2]。其中，最主要的成分是蜡质，它分布在细胞壁最外层形成完整的蜡样外壳，因此一般染液难以渗透而染色不佳，但实践证明苯酚碱性品红可通过延长时间或加热与结核杆菌细胞壁相结合成复合物而着色，这种物质可抵抗酸性物质的脱色[3]，因此在病理组织切片中经酸脱色后仍呈红色的杆菌为结核杆菌，这就是结核杆菌着色的特异性。

传统Ziehl-Neelsen抗酸染色法不但阳性率低而且存在以下缺点：①需苯酚碱性品红液常温复染1 h，不但费时而且操作时间太长苯酚碱性品红液出现干涸影响制片质量；②苯酚碱性品红液复染时对组织切片加热可缩短染色时间，但在工作中我们发现加热的时间和温度往往不易控制，而且加热时染液蒸发快也容易出现组织切片干涸现象。

为了提高抗酸染色的阳性率，我们根据抗酸杆菌的细胞壁结构特点和着色特异性，从以下几点对Ziehl-Neelsen抗酸染色法进行改良：①适当增加切片的厚度，5～6µm最为适宜，此厚度即能增加切片中菌体的含量而易于找到细菌，又能清晰地观察细菌的形态。②传统染色法用二甲苯脱蜡，由于二甲苯对于结核杆菌的脂质细胞壁有一定的破坏，致其与苯酚碱性品红相结合力减弱或消失，不易染色。改良染色法用汽油和松节油(体积比1：1)混合液替代二甲苯进行脱蜡，可使菌体细胞壁脂质不受破坏，保存菌体壁的完整性。与传统抗酸染色方法相比，改良抗酸染色方法检出的结核杆菌细菌量多，菌体粗且着色深。③按染色特性，结核杆菌分为抗酸性和嫌色性，后者完全丧失与苯酚碱性品红相结合力。滥用抗生素、治疗不当等行为可使杆菌从抗酸性部分或全部转为嫌色性，因此传统染色方法检测这类结核杆菌的阳性率往往比较低。嫌色性结核杆菌胞壁含有糖脂结构，高碘酸可使糖脂结构上两个带有羟基的相邻的碳键氧化成醛基，而碱性品红能与醛基发生反应，产生抗酸性的紫红色基团。因此，改良抗酸染色法中切片在苯酚碱性品红液染色前经过0.5%高碘酸处理，可使嫌色性结核菌获得抗酸染色的特性，从而使苯酚碱性品红与抗酸杆菌结合更加牢固，增强抗酸杆菌染色效果[4]。④针对结核杆菌菌体胞壁上含有不等量的脂质，一般染液难以渗透而不易着色的热点，改良抗酸染色法中切片在苯酚碱性品红液染色前先用TritonX-100处理。TritonX-100是非离子型表面活性剂，具有与极性分子和非极性分子相结合的亲水基团和亲油基团，能降低物质界面的张力和溶解脂质，因此能使菌体胞壁中的脂类在短时间内脱去，增加细胞膜的通透性，提高染液的渗透力，使苯酚碱性品红能顺利地渗入菌体壁，使染色效果得到明显改善[5]，对提高抗酸杆菌检出率有一定的作用。⑤乙醇可脱去结核杆菌体表面的蜡质，破坏菌体细胞壁完整性而容易造成染色结果假阴性，因此改良抗酸染色法整个操作过程都不经乙醇浸洗。⑥20%硫酸水溶液褪色较弱，时间稍长影响不大，因此改良抗酸染色法用20%硫酸进行分化，操作过程更容易操控。

[1]王伯沄,李玉松,黄高昇,等.病理学技术[M].北京:人民卫生出版社,2000:160.

[2]梁英杰,凌启波,张威.临床病理学技术[M].北京:人民卫生出版社,2011:116.

[3]徐开军,孙涛.抗酸染色中碱性品红用量分析[J].临床与实验病理学杂志,2014,30(11):1315.

[4]胥维勇.氧化剂和表面活性剂在抗酸染色中的应用[J].临床与实验病理学杂志,2013,29(1):103-104.

[5]王德田,董建强.实用现代病理学技术[M].北京:中国协和医科大学出版社,2012:133-134.

R446.8

B

1003—6350(2017）09—1523—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.09.053

2016-11-16)

陈世梁。E-mail：chenshiliang168@163.com