牛奶中四环素类兽残的快速检测关键技术应用研究

黄闯，孙芝杨，李新建，杨福臣，孔令伟

（1.江苏食品药品职业技术学院江苏省食品加工工程技术研究开发中心，江苏淮安223003；2.淮安快鹿牛奶有限公司，江苏淮安223001）

牛奶中四环素类兽残的快速检测关键技术应用研究

黄闯1，孙芝杨1，李新建1，杨福臣1，孔令伟2

（1.江苏食品药品职业技术学院江苏省食品加工工程技术研究开发中心，江苏淮安223003；2.淮安快鹿牛奶有限公司，江苏淮安223001）

介绍四环素类兽残快速检测的几种常用方法及区别，并就目前市场上3种典型牛奶用液相色谱－质谱/质谱法，进行土霉素、四环素、金霉素、强力霉素4种抗生素检测，结果表明3种牛奶中四环素含量均低于检出限，效果较好。

四环素；快速检测；液相色谱；质谱；抗生素

自上世纪70年代以来，动物中用于促生长、同步发情、治疗和预防作用的兽药不断增加，使得食品组织和产品中药物残留的危害日趋严重[1]。由于牛乳中含有大量VA、VB、VD，有助于身体发育和成长，因此乳制品已成为人们日常生活必需品。四环素等兽药的使用给人类和环境造成了极大的危害[2－4]。为了对食品进行全程管理和监控，必须要求有快速、方便、准确、高灵敏度、高通量的快速检测方法的出现[5－6]。

目前兽药残留检测快速筛选方法最常用的是微生物法[7－8]、免疫学快速检测[9－10]、理化检测法等几种常用方法[11]。其他有李琴[12]利用生物芯片技术，对乳及乳粉中β－兴奋剂类残留进行半定量的快速筛查，穆小婷等[13]将生物芯片技术用于致病微生物和其他药物残留的检测；李延华等[14]用试管扩散法对牛乳中β－内酰胺类抗生素残留进行检测，较国标TTC法简便、快速；帝斯曼[15]发明了Delvotest BLF试剂盒，检测头孢菌素只需5 min；Jeon等[16]以ELISA试剂盒检测牛乳中的四环素，检测限低；Knecht等[17]利用ELISA[18－19]模式可检测牛乳中10种抗生素残留，检出限低，检测时间快；Zhang等[20]将四环素结合到DNA适体并固定到玻碳电极上[21]，记录循环伏安图，检测快；Fernández等[22]通过表面等离子共振装置检测牛乳中多种抗生素残留；Adrian等[23]报道了一种类传感器的方法，通过免疫传感器与光学传感器[24]设备结合，可用于牛乳中四环素等兽药的检测[25]；张利萍等[26]建立了磁分散萃取－液相色谱法同检测牛乳中四环素类药物残留，简便快速、低成本；邓江华[27]利用醇与小分子有机溶剂二元双水相分离萃取四环素类药物残留，萃取率达90%以上；Wierucka等[28]应用磁性固相萃取技术检测食品中四环素类残留，效果较好；王丽敏[29]建立了基于分子印迹有机-无机复合材料的固相萃取与液相色谱方法检测牛奶中四环素残留，回收率在88%以上，检出限低；彭凌雪[30]建立了正丁醇/乙醇/NaH2PO4、正丁醇/乙醇/（NH4）2SO4二元双水相体系对环境中四环素类兽残进行分离/富集，萃取率在92%以上；Muetal[31]应用毛细管电泳法检测食物源中四环素，检出限为0.0745 μg/mL。

微生物法是根据抗菌药物对微生物生理功能、代谢的抑制作用，来定性或定量确定样品中药物残留。微生物法试剂盒适用于养殖场和食品加工车间。北美有STOP法、CAST法、FAST法，在欧盟有德国三碟实验法、欧盟四碟实验法。STOP法、CAST法检测时间在16 h～24h之间，FAST法只需6 h。德国三碟法是在3个平皿中设置不同的pH值，对氟喹诺酮类、氨基糖苷类、β2内酰胺类、四环素类敏感性较好；四碟法检测方法与四碟法相近，对大环内酯类、β2内酰胺类灵敏度较好。而牛乳等液体样品主要通过培养基pH等因素改变引起指示剂颜色变化来决定检测结果。其中，TTC法是我国鲜乳中抗菌药物残留检测的国标，采用嗜热链球菌，检测时间为2.5 h，对青霉素灵敏度为4 ng/g；Delvotest法为国际乳业联合会采用的标准方法，采用嗜热脂肪芽孢杆菌，可用安培瓶或Delvo SP检测样品，对青霉素G、四环素、磺胺类和红霉素灵敏度分别为2、100、50、50 ng/g；而Charm Science和Aria micro test为主要的试剂盒生化检测方法，对土霉素、庆大霉素、泰乐菌素灵敏度达到了100ng/g～150 ng/g、300 ng/g～500 ng/g、40 ng/g～50 ng/g，满足检测要求。

免疫学快速检测是基于抗原-抗体特异性反应的检测方法。常见的免疫分析有放射免疫[32]、酶联免疫吸附试验[33-34]和胶体金免疫分析[35]、荧光免疫分析[36]等。放射免疫由于采用放射性物质作为标记物，虽然灵敏度高，但不利于环境保护，限制了其广泛应用。酶联免疫要求兽药小分子和载体蛋白偶联，用作抗体生产的免疫原和检测的包被原，目前已开发了多种药物残留的ELISA试剂盒。胶体金免疫色谱试验测定又称胶体金试纸条、速测卡或速测试纸条，在pH8.2时，以非共价键与兽药小分子抗体结合形成金标抗体，吸附于玻璃纤维棉，检测时间仅需几分钟。荧光免疫分析采用荧光物质作为标记物，易受背景干扰，而新近的荧光偏振、荧光萃取增强和时间分辨荧光免疫测定灵敏度较高。

理化检测在食品的快速检测中也有应用，但更多的时候是作为确证方法使用。该类方法主要由不同检测系统组成的两种类型，即高效液相色谱[37-39]和高效薄层色谱。由于具有快速、灵敏度和精密度高、回收效果好等特点，高效/超高效液相色谱或液相色谱联用法较之其他方法在检测复杂基质中四环素类药物残留上应用更广泛[40]。本试验采用液相色谱-质谱/质谱法，对牛乳中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素4种抗生素进行检测，以期为牛乳中四环素类抗生素的残留分析提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

Waters Oasis HLB固相萃取柱、Waters 2695高效液相色谱仪配2489紫外检测器：美国Waters公司；AL204电子天平：梅特勒-托利多仪器公司；吹氮浓缩仪：美国OrganomationAssociates Jnc公司；EYELAOSB-2000旋转仪蒸发仪：日本EYELA公司；80-2型离心机：上海医疗器械集团；H66MC超声波发生器：无锡市超声电子设备厂。

1.2 试剂与溶液

甲醇、乙腈（色谱纯）：美国Meck公司；乙酸乙酯、乙二胺四乙酸钠、三氟乙酸、柠檬酸、磷酸氢二钠（分析纯）：天津市光复精细化工研究所；标准品（四环素、土霉素、金霉素、强力霉素）：纯度均大于95%，中国药品生物制品检定所。

1.3 标准贮备液及标准工作溶液的制备

1.3.1 标准储备溶液

准确称取按其纯度折算为100%质量的四环素、土霉素、金霉素、强力霉素各10.0 mg，分别用甲醇溶解并定容至100 mL，浓度相当于100 mg/L，储备液在-18℃以下贮存于棕色瓶中，可稳定12个月以上。

1.3.2 混合标准工作溶液

根据需要，用甲醇+三氟乙酸水溶液将标准储备溶液配制为适当浓度的混合标准工作溶液，使用前配制。

1.4 试样制备

从所取全部样品中取出约500g，充分混匀，装入洁净容器中，密封，并标明标记，于-18℃以下冷冻存放。

称取混匀试样5 g（精确到0.01 g），置于50 mL比色管中，用0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine缓冲溶液溶解并定容至50 mL，漩涡混合1 min，冰水浴超声10 min，转移至50mL聚丙烯离心管中，冷却至0～4℃，5 000 r/min离心10 min（温度低于15℃），用快速滤纸过滤，待净化。

准确吸取10 mL提取液（相当于1 g样品）以1滴/s的速度过HLB固相萃取柱，待样液完全流出后，依次用5 mL水和5 mL甲醇+水淋洗，弃去全部流出液。2.0 kPa以下减压抽干5 min，最后用10 mL甲醇+乙酸乙酯洗脱。将洗脱液吹氮浓缩至干（温度低于40℃），用1.0 mL甲醇+三氟乙酸水溶液溶解残渣，过0.45 μm滤膜，待测定。

1.5 液质条件

1）色谱柱：Inertsil C8－3，5 μm，150 mm×2.1 mm（内径）。

2）流动相：甲醇+10 mmol/L三氟乙酸，梯度洗脱。

3）流速：300 μL/min。

4）柱温：30℃。

5）进样量：30 μL。

6）质谱条件：质谱扫描模式为多反应监测（MRM），单位分辨率，雾化气（NEB）为6.00 L/min（氮气），气帘气（CUR）为10.00L/min（氮气），喷雾电压（IS）为4500V，去溶剂温度（TEM）为500℃，去溶剂气流为7.00 L/min（氮气），碰撞气（CAD）为6.00 mL/min（氮气）。

2 结果与讨论

2.1 定性测定

待测样品中化合物色谱峰的保留时间与标准溶液相比变化范围应在±2.5%之内。

2.2 定量测定

根据样液中被测四环素类兽药残留的含量情况，选定峰高相近的标准工作溶液。标准溶液的色谱图参见图1。

图1 标准品重构离子色谱图Fig.1 Figure of standard product’s reconstructed ion chromatogram

2.3 空白试验

除不加试样外，均按1.4～1.5测定步骤进行。

2.4 测定最低检出限、RT值及定标曲线值

四环素、土霉素、金霉素、强力霉素的最低检出限均为0.05 mg/kg。

本试验任选市面上3种鲜牛乳，并分别标记为样品1、样品2、样品3。通过4种四环素类标准品即四环素、土霉素、金霉素、强力霉素，空白样及样品添加标准品进行对比，以下图2至图6为四环素各种重构离子色谱图。

图2 空白样中四环素重构离子色谱图Fig.2 Figure of blank’s reconstructed ion chromatogram

图3 样品1重构离子色谱图Fig.3 Figure of sample 1’s reconstructed ion chromatogram

图4 样品2重构离子色谱图Fig.4 Figure of sample 2’s reconstructed ion chromatogram

表1至表6为标品及各类样品数据结果统计。

样品1、样品2、样品3分别为××D20151012、×× 20150719 B3、××1A20151021DA01A6批次

由上图及表格数据可见，3个样品的兽药残留均低于检测限，即0.05 mg/kg。该方法灵敏度较好，检出限低，符合正常检测要求。

图5 样品3重构离子色谱图Fig.5 Figure of sample 3’s reconstructed ion chromatogram

图6 样品添加重构离子色谱图Fig.6 Figure of sample addition’s reconstructed ion chromatogram

表1 标准品检测结果Table 1 Detecting results of standard product

表2 空白样检测结果Table 2 Detecting results of blank

3 展望

乳品中兽药残留的状况引起了越来越多消费者、国家及国际组织的关注[41]，2014年中国、荷兰达成两项涉及乳品的协议[42]，项目完成后，将实现中国与欧盟乳品检测系统的同步[43]。高效、快速、方便、低成本的新型检测方法受到越来越多研究学者的关注。色谱法的定性和定量的分析效果好，准确度高。但是由于在检测混合型复杂样品时，检测成本高，在现场快速检测时受到限制。毛细管电泳技术也有成本高，检测范围不够广泛等缺点。免疫学快速检测由于灵敏度低，检测速度快，更适合于现场检测。胶体金免疫学方法因其方便、敏感无污染等特性，适合现场检测，是兽药残留免疫检测的发展方向。

表3 样品1检测结果Table 3 Detecting results of sample 1

表4 样品2检测结果Table 4 Detecting results of sample 2

表5 样品3检测结果Table 5 Detecting results of sample 3

表6 样品添加标准品检测结果Table 6 Detecting results of sample addition

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Study on the Key Technology of Rapid Detection of Tetracycline Residues in Milk

HUANG Chuang1，SUN Zhi－yang1，LI Xin－jian1，YANG Fu－chen1，KONG Ling－wei2
（1.Food Processing Engineering Technology Research and Development Center of Jiangsu Province，Jiangsu Food and Drug Vocational and Technical College，Huai′an 223003，Jiangsu，China；2.HUAIAN KUAILU MILK CO.，LTD.，Huai′an 223001，Jiangsu，China）

Several common rapid testing methods and their difference of veterinary drug residues were introduced in this paper.Three typical kinds of milk were detected by liquid chromatography－mass spectrum/mass spectrometry.The results of four kinds of antibiotics，which were oxytetracycline，tetracycline，chlortetracycline and doxycycline，were lower than the detection limits and were better.

tetracycline；rapid testing；liquid chromatography；mass spectrum；antibiotic

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.032

2016－08－22

淮安市科技支撑计划项目（HAS2014024）；2016年度江苏省“青蓝工程”资助项目（苏教师[2016]15号）

黄闯（1981—），男（汉），讲师，硕士，研究方向：食品安全与营养。