大菱鲆鱼皮多肽液的制备及其抗运动疲劳作用

杨俊峰

（内蒙古农业大学职业技术学院，内蒙古包头014109）

大菱鲆鱼皮多肽液的制备及其抗运动疲劳作用

杨俊峰

（内蒙古农业大学职业技术学院，内蒙古包头014109）

利用热水水解法制备大菱鲆鱼皮胶原蛋白。以制备的胶原蛋白为原料，利用复合蛋白酶酶解法制备大菱鲆鱼皮多肽液，并利用单因素和正交试验对复合蛋白酶酶解大菱鲆鱼皮胶原蛋白的工艺进行优化，并对得到的大菱鲆鱼皮多肽液的抗运动疲劳作用进行研究。结果表明，复合蛋白酶酶解法制备大菱鲆鱼皮多肽液的最佳酶解工艺为：温度50℃，pH 6.5，酶用量0.08%，酶解时间8 h。在此工艺条件下大菱鲆鱼皮胶原蛋白的水解度为68.35%。小鼠负重游泳实验和抗疲劳生化指标结果表明大菱鲆鱼皮多肽液具有良好的抗运动疲劳能力。

大菱鲆；鱼皮；多肽液；正交试验；抗运动疲劳

我国水产加工业发展迅速，大量的水产品通过深加工显著提升了其原有价值，其中有关鱼皮的深加工和营养价值的研究深受广大研究者的关注[1-3]。如罗非鱼鱼皮通过酶解法可得到具有良好抗氧化能力的胶原肽[4]。张振新等[5]利用响应面法优化了酶解废弃鱼皮的工艺，为废弃鱼皮的生产再利用提供了理论依据。刘成梅等[6]则利用超滤技术制备了罗非鱼鱼皮多肽，并对罗非鱼鱼皮多肽的抗氧化活性进行了深入研究。大菱鲆俗称欧洲比目鱼，在中国被称为“多宝鱼”，肉质鲜美，营养丰富，深受我国消费者喜爱，在20世纪90年代末，大菱鲆在我国北方沿海推广养殖，成为我国北方主要的海产品之一[7-8]。随着大菱鲆产量的增加和加工业的兴起，大菱鲆鱼皮的进一步加工利用将会成为提高大菱鲆经济效益的重要措施，然而目前此方面的研究并不多见。本研究以大菱鲆鱼皮为研究对象，利用复合酶解法，对大菱鲆鱼皮胶原蛋白进行酶解，并利用正交试验对酶解工艺参数进行优化，在此基础上对酶解得到的大菱鲆鱼皮多肽液进行抗运动疲劳的研究，以期为抗运动疲劳鱼皮多肽的开发利用提供参考。

1 材料与仪器

1.1 样品来源

大菱鲆鱼：大小均一，尾重（800±20）g，鲜活即杀，剥皮，并将剥好的鱼皮在-18℃下冷藏备用。

1.2 材料与试剂

小鼠：32只雄性小鼠，年龄均为8周，体重为（220± 14）g。

复合蛋白酶（120个单位/mg）：赫澎（上海）生物科技有限公司；茚三酮显色液：上海拓旸生物科技有限公司；氨基酸混合标准溶液：上海芃硕生物科技有限公司；尿素氮（BUN）检测试剂盒、乳酸测定试剂盒和糖原测试盒：上海江莱生物科技有限公司。

1.3 仪器与设备

FA系列电子分析天平：上海光学仪器厂；Sykam（赛卡姆）氨基酸分析仪：德国曼默博尔公司；ATN-500全自动凯氏定氮仪：上海平轩科学仪器有限公司；小鼠恒温游泳箱：安徽正华生物仪器设备有限公司。

2 方法

2.1 大菱鲆鱼皮胶原蛋白的制备

将冷冻的大菱鲆鱼皮室温解冻，清洗表面，按照林家福等[9]的研究利用热水水解法提取大菱鲆鱼皮胶原蛋白，热水提取法工艺条件为：温度90℃，pH6.0，固液比1∶13（g/mL），时间2 h，最后利用凯氏定氮法测定大菱鲆鱼皮蛋白得率为276 mg/g鱼皮，且得到的大菱鲆鱼皮胶原蛋白无异味。

2.2 大菱鲆鱼皮胶原蛋白水解度的测定

大菱鲆鱼皮胶原蛋白水解度利用直接测定法进行测定[10]。利用国家标准GB 5009.5-2010《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中的方法测定大菱鲆鱼皮胶原蛋白提取物中N的含量，利用茚三酮显色法测定多肽液中游离-NH2的含量。计算公示为：

式中：Nh为大菱鲆鱼皮胶原蛋白酶解液中的总游离-NH2数，mmol；N0为大菱鲆鱼皮胶原蛋白中固有的游离-NH2数，mmol；N总为大菱鲆鱼皮胶原蛋白强酸水解后的总游离-NH2数，mmol。

2.3 单因素试验

利用单因素试验分别研究温度（40、45、50、55、60℃）、pH（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）、酶用量（0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%）和酶解时间（2、4、6、8、10 h）对酶解法制备大菱鲆鱼皮多肽液的影响。

2.4 正交试验设计

为了进一步优化复合酶解法制备大菱鲆鱼皮多肽液的工艺，在单因素试验的基础上设计正交试验。选用温度、pH值、酶用量和酶解时间4个因素进行优化组合，因素与水平表见表1。

表1 正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

2.5 大菱鲆鱼皮多肽液抗运动疲劳作用分析

2.5.1 动物分组及给药

将32只雄性小鼠随机分为4组，A组为空白对照组，灌胃2.0 mL/d的生理盐水，B、C和D组分别灌胃5、20、35 mL/（kg·d）的大菱鲆鱼皮多肽液，并定义为低、中和高剂量组。灌胃量的确定参考苏永昌等的研究[11]。灌胃上述4组小鼠均灌胃30 d，期间小鼠自由饮水和进食。

2.5.2 大菱鲆鱼皮多肽液对小鼠负重游泳力竭时间的影响

小鼠末次灌胃30 min后，以负重量为小鼠体重的5%，对4组小鼠进行负重游泳试验。具体方法为将4组试验小鼠置于水温为25℃，水深为30 cm的游泳箱进行负重游泳试验，并记录4组小鼠首次下沉时间和力竭时间[12]。

2.5.3 大菱鲆鱼皮多肽液对小鼠抗疲劳生化指标的影响

小鼠负重游泳试验结束后休息1 d，随后进行无负重游泳30 min，采用试剂盒法对4组小鼠进行血清尿素氮（BUN）、血清乳酸（LD）和肝糖原（LG）测定。

2.6 数据分析

试验结果以平均数±标准偏差表示，并利用SPSS 20.0软件对试验数据进行分析，当P＜0.05时定义差异显著。

3 结果与分析

3.1 单因素试验

3.1.1 温度对大菱鲆鱼皮胶原蛋白水解度的影响

在温度为40、45、50、55、60℃下分析温度对大菱鲆鱼皮胶原蛋白水解度的影响，结果如图1所示。

图1 温度对大菱鲆鱼皮胶原蛋白水解度的影响Fig.1 Effect of the temperature on the DH of collagen of SMF

当温度为50℃时，大菱鲆鱼皮胶原蛋白水解度最高。

3.1.2 pH值对大菱鲆鱼皮胶原蛋白水解度的影响

在pH值为5.5、6.0、6.5、7.0和7.5下分析pH值对大菱鲆鱼皮胶原蛋白水解度的影响，结果如图2所示。

图2 温度对大菱鲆鱼皮胶原蛋白水解度的影响Fig.2 Effect of the pH on the DH of collagen of SMF

当pH值为6.5时，大菱鲆鱼皮胶原蛋白水解度最高。

3.1.3 酶用量对大菱鲆鱼皮胶原蛋白水解度的影响

在酶用量为0.02%、0.04%、0.06%、0.08%和 0.10%下分析酶用量对大菱鲆鱼皮胶原蛋白水解度的影响，结果如图3所示。

图3 酶用量对大菱鲆鱼皮胶原蛋白水解度的影响Fig.3 Effect of the enzyme dosage on the DH of collagen of SMF

随着酶用量的增加，大菱鲆鱼皮胶原蛋白的水解度也随之增加，但是当酶用量大于0.08%时，水解度的增加幅度减少，考虑到生产成本的问题，可以选择最优酶用量为0.08%。

3.1.4 酶解时间对大菱鲆鱼皮胶原蛋白水解度的影响在酶解时间为2、4、6、8、10 h下分析酶时间对大菱鲆鱼皮胶原蛋白水解度的影响，结果如图4所示。

图4 酶解时间对大菱鲆鱼皮胶原蛋白水解度的影响Fig.4 Effect of dissociation time on the DH of collagen of SMF

随着酶解时间的增加，大菱鲆鱼皮胶原蛋白的水解度也随之增加，但是当酶解时间大于8 h之后，水解度几乎不会发生改变，因此，最优酶解时间为8 h。

3.2 正交试验

为了得到酶解大菱鲆鱼皮胶原蛋白的最佳参数组合，在单因素试验的基础上进行正交试验，并进行方差分析，结果如表2、表3所示。

表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal experiment

续表2 正交试验结果Continue table 2 Results of orthogonal experiment

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

由表2可知，4个因素对大菱鲆鱼皮胶原蛋白水解度的影响顺序为：温度（A）＞pH值（B）＞酶解时间（D）＞酶用量（C），且最佳因素水平组合为A2B2C2D2，即温度50℃，pH 6.5，酶用量0.08%，酶解时间8 h。由表3方差分析可知，4个因素都对大菱鲆鱼皮胶原蛋白水解度有极显著的影响（P＜0.01）。根据最佳参数进行3次平行试验，大菱鲆鱼皮胶原蛋白水解度分别为68.93%、67.79%、68.33%，3次试验的平均值为68.35%，其结果高于正交试验各组的水解度。

3.3 大菱鲆鱼皮多肽液抗运动疲劳作用研究

3.3.1 大菱鲆鱼皮多肽液对小鼠负重游泳力竭时间的影响

记录4组小鼠游泳首次下沉和游泳力竭时间，结果如图5所示，与对照组相比（A），灌胃低（B）、中（C）和高（D）剂量大菱鲆鱼皮多肽液的3组小鼠的游泳首次下沉时间和力竭时间得到了显著的延长（P＜0.05），并随着灌胃剂量的增加而增加，这说明大菱鲆鱼皮多肽液具有良好的抗运动疲劳作用。

图1 大菱鲆鱼皮多肽液对小鼠游泳耐力的影响Fig.1 Effects of PISMF on swimming endurance of mices

3.3.2 大菱鲆鱼皮多肽液对小鼠抗疲劳生化指标的影响

为了进一步研究大菱鲆鱼皮多肽液对小鼠的抗运动疲劳作用，利用试剂盒法测定4组小鼠血清尿素氮、血乳酸和肝糖原含量，结果如表4所示。

表4 大菱鲆鱼皮多肽液对运动后小鼠血清尿素氮、血乳酸和肝糖原含量的影响Table 4 Effects of PISMF on serum urea nitrogen，blood lactic acid and the content of hepatic glycogen of mices after exercising

与空白对照组相比，低、中和高剂量组的小鼠血清尿素氮和血乳酸的含量都显著的降低（P＜0.05），而肝糖原含量显著增加（P＜0.05）。运动时间过长机体会产生大量的血尿素氮，如果是激烈的无氧运动，血液中则会产生大量的乳酸，使人体产生疲劳感；而肝糖原是机体运动的主要能量来源，一定含量的肝糖原能够减轻运动疲劳感[12－13]。可见，大菱鲆鱼皮多肽液是通过减少机体血清中尿素氮和血乳酸的含量，并通过增加肝糖原含量来达到抗疲劳的作用。

4 结论

本研究优化了复合酶法制备大菱鲆鱼皮多肽液的工艺参数，结果表明，大菱鲆鱼皮胶原蛋白水解度的影响顺序为：温度＞pH值＞酶解时间＞酶用量，复合蛋白酶酶解法制备大菱鲆鱼皮多肽液的最佳酶解工艺为：温度50℃，pH 6.5，酶用量0.08%，酶解时间8 h。此条件下大菱鲆鱼皮胶原蛋白的水解度为68.35%。此外，通过小鼠负重游泳试验表明大菱鲆鱼皮多肽液具有抗运动疲劳能力，且是通过减少血清中尿素氮和血乳酸，和增加肝糖原含量。

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Preparation and Anti-exercise-fatigue Activity of Peptide Liquid from Scophthalmus maximus Fishskin

YANG Jun-feng
（Vocational and Technical College of Inner Mongolia Agricultural University，Baotou 014109，Inner Mongolia，China）

The collagen of Scophthalmus maximus fishskin（SMF）was prepared using the hot water extraction，and was used as the raw material for further study.The peptide liquid of Scophthalmus maximus fishskin（PISMF）was prepared using the compound proteinase enzyme hydrolysis method，which was optimized using the single factor experiment and orthogonal experiment.In addition，the anti-exercise-fatigue activity of PISMF was analyzed.The results showed that the optimum enzyme hydrolysis condition of collagen of SMF using compound proteinase enzyme hydrolysis method was：temperature 50℃，pH 6.5，enzyme dosage 0.08%，dissociationtime 8h.Under the optimum conditions，the enzymatic hydrolysis degree ofcollagenofSMF was 68.35%.The results of the weight-loaded swimming test and the biochemical indicators associated with fatigue showed that PISMF had a good resistance to movement fatigue.

Scophthalmus maximus；fishskin；peptide liquid；orthogonalexperiment；anti-exercise-fatigue

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.023

2016-10-04

杨俊峰（1979—），男（汉），讲师，硕士，研究方向：食品科学，食品营养分析与安全检测。