雌激素受体单核苷酸多态性与子宫颈癌的相关性研究

陈莉婷，彭 敏，莫菊玲

(佛山市妇幼保健院妇科，广东 佛山 528000)

雌激素受体单核苷酸多态性与子宫颈癌的相关性研究

陈莉婷，彭 敏，莫菊玲

(佛山市妇幼保健院妇科，广东 佛山 528000)

目的 探讨雌激素受体(GPR30)单核苷酸多态性与子宫颈癌的相关性。方法 选取114例子宫颈癌患者为研究组，同数量子宫息肉及子宫肌瘤等良性疾病者为对照组，采用S-P免疫组化法测定子宫颈癌组织GPR30表达，PCR-RFLP法测定GPR30(rs3808351)位点基因多态性。结果 对照组与研究组在怀孕次数、首次性生活年龄、文化程度及HPV感染方面有统计学差异(χ2=20.64、14.05、10.11、39.71，P<0.05)；研究组GPR30阳性表达率显著高于对照组(χ2=12.65，P<0.05)；对照组与研究组GG、AA基因型比较差异有统计学意义(χ2值分别为6.14、5.89，均P<0.05)，G、A等位基因频率比较差异有统计学意义(χ2值分别为5.63和5.76，均P<0.05)；Logistic回归分析显示，怀孕次数(OR=1.659，95%CI：1.231～4.964，P<0.05)、HPV感染(OR=1.778，95%CI：1.196～3.854，P<0.05)、G等位基因频率(OR=2.239，95%CI：1.545～7.032，P<0.05)为子宫颈癌的危险因素。结论 GPR30(rs2808350)位点G等位基因频率可能为子宫颈癌的发生危险因素。

G蛋白偶联受体30；子宫颈癌；单核苷酸多态性；基因

宫颈癌是临床上较为常见的恶性肿瘤之一。近年来，研究发现大量服用避孕药与宫颈癌的发生发展密切相关。雌激素具有促进敏感靶器官、组织或者细胞异常变化的作用[1]。有报道指出，雌激素能够促进宫颈靶细胞增殖，并且进一步启动、促进致癌过程[2]。G蛋白耦联受体30(G protein coupled receptor 30，GPR30)是一种真正的雌激素膜性受体，其在乳腺癌、子宫内膜癌及子宫颈癌中高度表达[3]。另有研究报道，雌激素受体基因(ERα、ERβ)与子宫颈癌显著相关[4-5]。但目前对于GPR30基因多态性与子宫颈癌的关系研究报道较少。本研究旨在探讨GPR30基因(rs3808351)位点基因多态性与子宫颈癌的关系，从而为宫颈癌的病因、发病机制提供科学的理论依据。

1资料与方法

1.1临床资料

选取2013年3月至2016年3月在佛山市妇幼保健院妇科住院且行子宫颈癌切除术114例患者作为研究对象(研究组)，年龄在29～71岁，中位年龄48岁。患者均未在术前接受放疗、化疗。根据WGO(2003版)将子宫颈癌(cervical carcinoma，CC)行子宫颈癌组织学分类：高分化21例，中分化80例，低分化13例。按照国际妇产科联盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO)标准行临床分期：Ⅰ期93例，Ⅱ期21例；出现淋巴结转移者24例，未出现淋巴结转移者90例；肌层浸润深度≥1/2者62例，肌层浸润深度<1/2者52例；有脉管癌栓者47例，无脉管癌栓者67例；病理分类中子宫颈鳞癌92例，腺癌22例。选取同期妇女包括子宫息肉及子宫肌瘤等良性疾病者114例作为对照组，行子宫良性病变切除术。所有研究对象均签订知情同意书，并经医院伦理委员会批准执行。

1.2方法

1.2.1标本收集与处理

采用医院自制的调查问卷收集所有研究对象的一般人口学特征，包括身高、体重、月经史、性生活史、生育史等，以及HPV感染等子宫颈癌相关危险因素。在此基础上，采集未绝经者的月经周期的第8～10天肘静脉血5mL，绝经者在入院后次日清晨抽取肘静脉血5mL，以3 000r/min离心15min，分离血清及血块，血清置于-80℃冰箱中保存备用。收集子宫颈癌患者和对照组宫颈组织。

1.2.2雌激素受体GPR30检测

采用S-P免疫组化法检测研究组、对照组宫颈组织的GPR30。所有标本经10%甲醛固定、石蜡包埋，切成每张4μm厚。切片经脱蜡、酒精梯度水化后，经PBS冲洗3次。加入过氧化氢酶37℃孵育30min后，加入柠檬酸缓冲液高温修复7min，冷却后采用PBS冲洗。滴加血清封闭液室温孵育。滴加一抗(GPR30均为1:500)，4℃过夜。PBS冲洗3次，二抗37℃孵育30min，PBS冲洗3次后，采用DAB染色。经苏木复染，清水返蓝。脱水，透明树脂封片，光学显微镜下观察细胞。结果判定：GPR30阳性细胞多染色位于细胞质，可见棕黄色细颗粒，偶见细胞膜、核膜着色为棕黄色。采用半定量评分方法评估染色结果。每例随机选取5个高倍镜视野，观察细胞着色程度及阳性细胞数，其中阳性细胞着色程度评分：无色计为0分，淡黄色计为1分，棕黄色计为2分，黄褐色计为3分。阳性细胞所占百分比评分： 5%及以内计为0分，6%～25%计为1分，26%～50%计为2分，51%～75%计为3分，大于75%计为4分。将着色程度与阳性细胞百分比两者评分相乘，其中阴性(-)为0分，弱阳性(+)为1～4分，中度阳性(++)为5～8分，强阳性(+++)为9～12分。所有标本均由经验丰富的病理医师诊断证实。

1.2.3采用聚合酶链反应扩增技术(PCR)基因单核苷酸多态性

采用酚氯仿异戊醇法测定患者外周血细胞基因组中的DNA。采用Light Scanner Primer Design软件设计GPR30基因相应位点引物，均采用小片段扩增引物。PCR引物：其中GPR30(rs3808351)(G)上游5′-CTGACGTATT￣CTACGGGTCCATA-3′，下游5′-ACTGAG￣CGGGTCGTTTACGA-3′。引物合成由上海生工生物工程有限公司合成。PCR扩增体系为25L，其中含有5L PCR Mix，上、下游引物各0.5L，1L LC Green和1L DNA模板，剩余加入双蒸水。扩增反应条件为：95℃预变性2min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，94℃变性30s，30℃退火30s，共计40个循环，完成后采用73℃延伸5min。PCR产物纯化采用小牛肠碱性磷酸酶和外切酶bs-13119R。全部测序均由ABI3100测序分析仪完成。为准确测定基因分型结果，随机选取10%的样本采用直接测序法进行验证。

1.3统计学方法

所得数据符合正态分布，计数资料以百分率表示，采用χ2检验。群体基因型采用Hardy-Weinberg平衡检验。SNP位点与子宫颈癌的遗传效应之间的相关性采用非条件Logistic回归分析，并经多重检验，P值经Bonferroni进行校正。所有数据均经SPSS 19.0统计软件分析所得，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1子宫颈癌发生相关因素

对照组与研究组在BMI、年龄方面差异无统计学意义(P>0.05)，而在怀孕次数、首次性生活年龄、文化程度及HPV感染方面差异有统计学意义(χ2值分别为20.64、14.05、10.11、39.71，均P<0.05)，见表1。

表1 子宫颈癌发生相关因素分析[n(%)]

2.2 GPR30表达情况

免疫组化结果显示，研究组GPR30阳性表达率显著高于对照组(χ2=12.65，P<0.05)，见表2、图1。

表2 两组患者GPR30表达情况[n(%)]

Table 2 Expression of GPR30 in two groups[n(%)]

组别 例数(n)(-)(+)(++)(+++)阳性率(%)对照组11484(73．68)21(18．42)6(5．26)3(2．64)26．32研究组11421(18．42)24(21．05)39(34．21)30(26．31)81．58χ212．65P0．000

注：A：对照组；B：研究组

图1 免疫组化检测GPR30表达情况(×400)

Fig.1 Immunohistochemical detection of GPR30 expression(×400)

2.3 GPR30(rs3808351)位点基因型及扩增结果

PCR扩增产物片段长度为231bp，GPR30(rs3808351)位点酶切中呈现一条亮的且长度为231bp的条带为GG型；出现196bp、231bp两条亮带的为GA型，出现在196bp的一条条带为AA型。随机选取GPR30基因型PCR扩增产物行基因测序，结果显示碱基的改变与酶切结果一致，见图2、图3。

图2 GPR30基因扩增产物电泳图

Fig.2 GPR30 gene amplification product electrophoresis

图3 GPR30基因聚合酶链反应测序结果

Fig.3 Results of polymerase chain reaction of GPR30 gene

2.4 GPR30(rs3808351)位点基因型分布

对照组与研究组GPR30(rs3808351)位点G、A等位基因频率分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，说明符合群体代表性。对照组与研究组GG、AA基因型比较差异有统计学意义(χ2值分别为6.14、5.89，均P<0.05)，G、A等位基因频率比较差异有统计学意义(χ2值分别为5.63、5.76，均P<0.05)，详见表3。

表3 GPR30(rs3808351)位点基因型分布[n(%)]

2.5 子宫颈癌危险因素的多变量回归分析

将单因素分析中有统计学意义的因素行多变量的Logistic回归分析，以子宫颈癌为因变量，以年龄、怀孕次数、首次怀孕年龄、文化程度、HPV感染及G等位基因频率为自变量。结果显示，怀孕次数(OR=1.659，95%CI：1.231～4.964，P<0.05)、HPV感染(OR=1.778，95%CI：1.196～3.854，P<0.05)、G等位基因频率(OR=2.239，95%CI：1.545～7.032，P<0.05)为子宫颈癌的危险因素。

3讨论

3.1 GPR30受体与宫颈癌的关系

宫颈癌是妇女中较为常见的生殖道恶性肿瘤之一，且有年轻化趋势。Shulman[6]于2000年研究发现，口服避孕药有增加宫颈癌发生的风险。宫颈癌的发生发展与性激素之间关系的研究日益引起广泛的重视。激素是调节机体生理功能的重要化学物质，任何原因导致激素分泌紊乱、内分泌失调都有可能使敏感的器官、组织或者细胞发生异常变化，如细胞异常增殖甚至出现癌变等[7]。受体是激素发挥生理效应的重要介质，也是激素与肿瘤发生关系的关键环节。GPR30是一种真正的雌激素膜性受体，能够在多种细胞中快速调节雌激素依赖性转录[8]。有研究发现，GPR30参与多个信号途径介导雌激素快速非基因组效应及基因组的转录效应，同时也参与恶性肿瘤的发生、发展，如子宫内膜癌、卵巢癌及乳腺癌等[9]。罗浩军等[10]于2009年研究报道指出，GPR30参与细胞的作用机制可能有以下几个方面：①调节激酶的活性；②生成第二信使；③调节基因的转录。目前已经有报道指出，GPR30在乳腺癌细胞中表达[11]；同时也有研究发现，GPR30在子宫内膜癌及乳腺癌中高度表达。本研究采用免疫组化检测子宫颈组织，结果显示研究组子宫颈癌组织中GPR30阳性表达率显著高于对照组[12]。这也印证了符敏等[13]的研究报道。

3.2 GPR30受体基因多态性与宫颈癌的关系

近年来，雌激素受体ERα基因Pvu Ⅱ和Xba Ⅰ基因多态性与子宫内膜癌、乳腺癌及子宫颈癌的易感性有关，ERβ与乳腺癌的易感性有关。有研究报道，GPR30基因(rs2808350)位点G等位基因频率与子宫肌瘤的发生发展密切相关[9]。但目前对于GPR30基因多态性与子宫颈癌的关系研究报道较少。通过本研究发现，对照组与研究组GG、AA基因型比较差异有统计学意义，G、A等位基因频率比较差异有统计学意义。通过Logistic回归分析发现，G等位基因频率是子宫颈癌发生的危险因素(OR=2.239，95%CI：1.545～7.032)，表明G等位是子宫颈癌的易感基因。

3.3 HPV感染与GPR30的关系

在宫颈癌的发病中，HPV感染在致病因的研究中已经得到公认。研究表明，单纯的HPV感染并不能导致宫颈癌变，在与其他因素协同作用下才会导致宫颈癌的发生[14]。大量口服避孕药且有HPV感染者，宫颈癌发生的风险比例显著增加。本研究显示，HPV感染是子宫颈癌发生发展的危险因素，其可能与GPR30高表达这一协同作用有关。

综上所述，GPR30(rs2808350)位点G等位基因频率可能为子宫颈癌的发生危险因素。

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[专业责任编辑： 安瑞芳 ]

Association of estrogen receptor single nucleotide polymorphism with cervical cancer

CHEN Li-ting, PENG Min, MO Ju-ling

(DepartmentofGynecology,FoshanMaternalandChildHealthCareHospital,GuangdongFoshan528000,China)

Objective To investigate the association of single nucleotide polymorphism of estrogen receptor (GPR30) and cervical cancer. Methods Totally 114 cases of cervical cancer were selected in study group, while the same number of cases of uterine polyps, uterine fibroids and other benign diseases were in control group. GPR30 expression in cervical cancer tissues was determined by S-P immunohistochemical method, and PCR-RFLP method was used for the determination of GPR30 (rs3808351) gene polymorphism. Results There were statistical differences in the times of pregnancies, the first sex age, education level and HPV infection between the study group and the control group (χ2value was 20.64, 14.05. 10.11 and 39.71, respectively, allP<0.05). The positive rate of GPR30 in the study group was significantly higher than that in the control group (χ2=12.65,P<0.05). GG and AA genotypes were significantly different between the study group and the control group (χ2value was 6.14 and 5.89, respectively, bothP<0.05), so were the allele frequencies of G and A (χ2value was 5.63 and 5.76, respectively, bothP<0.05). Logistic regression analysis showed that the number of pregnancies (OR=1.659, 95%CI: 1.231-4.964,P<0.05), HPV infection (OR=1.778,95%CI: 1.196-3.854,P<0.05) and G allele (OR=2.239, 95%CI: 1.545-7.032,P<0.05) were the risk factors for cervical cancer. Conclusion G allele frequency on GPR30 (rs2808350) locus may be the risk factors for cervical cancer.

G-protein coupled receptor 30 (GPR30); cervical cancer; single nucleotide polymorphism; gene

2016-06-16

陈莉婷(1979-)，女，主治医师，硕士研究生，主要从事妇科肿瘤、妇产科介入治疗等研究。

彭 敏，主任医师。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.02.016

R711.74

A

1673-5293(2017)02-0145-04