免疫磁珠酶催化新技术在H7N9流感病毒高灵敏检测中的应用

刘 键，王艳丽，赵 勇，，吴学敏，（中国检验检疫科学研究院，北京0076；河南省人口和计划生育科学技术研究院，河南郑州5000；北京诺禾致源科技股份有限公司，北京迪安临床检验所有限公司，北京069）

·检验与转化医学·

免疫磁珠酶催化新技术在H7N9流感病毒高灵敏检测中的应用

刘 键1，王艳丽2，赵 勇1，3，吴学敏1，4（1中国检验检疫科学研究院，北京100176；2河南省人口和计划生育科学技术研究院，河南郑州450002；3北京诺禾致源科技股份有限公司，4北京迪安临床检验所有限公司，北京102629）

目的：H7N9型禽流感是一种致病性较强的流感病毒亚型，该型流感病毒于2013年3月底在我国发现以来，已造成多人死亡，目前对此病毒还没有疫苗，没有特效药，死亡率一直居高不下.在当今病原体检测的主要方法中，病原体培养分离法、核酸扩增法以及ELISA方法灵敏度较高，但需要专业仪器设备和专业的实验室；胶体金法检测快速、操作简便，但是，胶体金检测灵敏度低.因而，结合当前国内外的最新科学发展，寻求一种快速、高灵敏、可现场检测的新技术尤为迫切.方法：本研究结合海关口岸对传染病病原体检验检疫的需求，利用纳米磁颗粒具有酶催化活性的特点，结合免疫层析技术，以H7N9病原体为检测样本，分析该新技术对H7N9病原体检测的敏感性与可靠性.结果：该新技术检测的敏感度比胶体金法可提高12个数量级.结论：该方法兼具胶体金技术的快速、简便、可现场应用的优点，又具有高灵敏度的特性，具有发展为我国海关口岸检验检疫新技术平台的潜力.

纳米磁珠；酶催化作用；高灵敏；H7N9

0 引言

有史以来，传染病一直侵扰着人类，历史上曾造成过几次大的瘟疫，对人类的健康带来了巨大的威胁.据世卫组织报告（2012－12－20），在过去30多年时间里至少出现了30种人类新发传染病，包括2003年爆发的SARS疫情（中国）、2014年爆发的埃博拉（Ebola）疫情（西非国家）［1］、2015年爆发的中东呼吸综合征（MERS）疫情（韩国）［2－3］，2015年5月爆发的寨卡病毒（Zika）疫情（巴西）［4－5］，这些疫情的爆发均预示着人类将面临更多新发或再发传染病的挑战.流感是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，流感病毒颗粒外膜由两种表面糖蛋白覆盖，一种为血细胞凝集素（hemagglutinin，H），另一种为神经氨酸酶（neuraminidase，N），H又分为15个亚型，N分为9个亚型.流感病毒可分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，其中甲型流感依据流感病毒特征可分为HxNx共135种亚型，H7N9型禽流感就是其中一种致病性较强的亚型.该型流感病毒于2013年3月底在我国的上海和安徽两地率先发现［6］.截至2016年1月10日，全国已确诊该病134人，死亡37人，痊愈76人，病例分布于北京、上海、江苏、浙江、安徽、山东、河南、台湾、福建、东莞、汕尾等地.这种病和普通呼吸道疾病差不多，但是非常危险，目前尚无疫苗、特效药，死亡率一直居高不下，因此，研制该病的快速、高灵敏的检测方法十分必要.

图1 H7N9型禽流感病毒［6］

目前，病原体检测的主要方法有培养分离法［7］、核酸扩增法［8－9］、ELISA法［10］和胶体金试纸条检测［11］等.在这些方法中，病原体培养分离法、核酸扩增法以及ELISA方法灵敏度较高，但需要专业仪器设备和专业的实验室；而胶体金法检测快速、操作简便，最有可能广泛应用于病原体现场筛查的海关口岸检验检疫领域，但是，胶体金检测灵敏度低，这一缺点严重制约了其在检验检疫领域的大范围应用.免疫磁珠（immunomagnetic beads，IMB）是近年来发展起来的一项新的免疫学技术，它将磁珠特有的优点与免疫学反应的高度特异性结合于一体，以免疫学为基础，渗透到医学、生物学等各个领域.免疫磁珠常应用于生化样品复杂组分的分离，可有效提高分离速度和富集效率［12－14］.2007年，中科院阎锡蕴院士课题组发现磁纳米颗粒（magnetic nanoparticles，MNPs）具有模拟过氧化物酶的催化功能（被命名为纳米酶），能催化过氧化物酶的底物TMB（3，3'，5，5'⁃四甲基联苯胺，3，3'，5，5'⁃Tetramethylbenzidine）、DAB（二氨基联苯胺，3，3'⁃diaminobenzidine）、OPD（二氨基联苯胺，3，3'⁃diaminobenzidine）显色［15－16］，进一步放大信号，这一发现拓展了磁纳米材料在生物、医学、检测等多领域的应用.2015年，该课题组又首次将磁纳米颗粒的酶催化活性与免疫层析技术相结合，实现了埃博拉假病毒的高敏感检测［17］.这些研究报道说明免疫磁珠酶催化技术有望提高现有胶体金免疫层析技术的敏感性，可为我国海关口岸检验检疫提供一种快速、简便、高敏感、可现场使用的新技术.为了检验这一新技术的可行性及其潜在的应用前景，本研究以H7N9流感病毒为例，基于磁珠纳米颗粒的酶催化放大特性，开展了免疫磁珠酶催化新技术在流感病毒高灵敏检测中的应用研究，并对比免疫磁珠层析与胶体金免疫层析的检测结果，评价其在海关口岸检测中的应用前景.

1 材料和方法

1.1 实验材料和仪器FeCl3·6H2O、醋酸钠、乙二醇、乙醇（北京化学试剂厂），TMB显色液（中杉金桥），高温烘箱（天津泰斯特），透射电镜（JEOL 2000FX 200KV，日本电子公司），酶联免疫分析仪（Bio⁃Rad，伯乐生命医学产品有限公司），喷膜机（imagene technology，New Hampshire，USA），切条机（上海金标）.

1.2 免疫磁珠酶催化新技术的设计思路利用磁珠纳米颗粒酶催化的特性，采用胶体金试纸条类似的设计策略，将胶体金纳米颗粒替换为具有酶活性的磁珠纳米颗粒，与检测抗体偶联，从而构建免疫磁珠抗体探针.当免疫磁珠抗体探针与样品中的H7N9病原体结合后，层析至试纸条的检测线（T线，喷涂有H7N9的捕获抗体）与对照线（C线，喷涂有羊抗鼠抗体）时，免疫磁珠抗体探针与H7N9的复合物就会与T线处的捕获抗体、C线处的羊抗鼠抗体结合，从而在T线与C线形成磁珠纳米颗粒的聚集，这时加入过氧化物酶的底物如DAB，由于磁珠纳米颗粒的酶活性，就会催化DAB发生化学反应生成大量棕褐色的沉淀，将检测信号放大10～100倍，实现H7N9的快速高敏感检测（图2）.

图2 高敏感免疫磁珠酶催化试纸条检测技术

1.3 磁珠纳米颗粒的合成与表征、酶活性测试根据水热法的文献报道［18］，合成磁珠纳米颗粒.FeCl3·6H2O溶解于乙二醇中，然后加入一定量的醋酸钠，混合后封装于高压反应容器中，200℃反应16 h，得到的产物用乙醇清洗3次，然后烘干保存.得到的磁珠纳米颗粒用透射电镜（JEOL 2000FX 200KV）表征其形态和均一性.另外，对合成的磁珠纳米颗粒，测试其酶催化活性，实验过程：96孔板中，每100 μL TMB显色液为一反应体系，分别在每一反应体系中加入0、0.5、1、2、4、8 μg的磁珠纳米颗粒，每一浓度的反应做3个重复，室温反应5 min后，酶联仪读取OD 652的吸光度值.

1.4 免疫磁珠抗体探针的制备免疫磁珠抗体探针的制备依据文献报道［19］，首先将5 mg的EDC（1⁃（3⁃二甲氨基丙基）⁃3⁃乙基碳二亚胺盐酸盐，1⁃（3⁃Dime⁃thylaminopropyl）⁃3⁃ethylcarbodiimidehydrochloride）（Sigma⁃Aldrich）与NHS（N⁃羟基琥珀酰亚胺，N⁃Hydroxysuccinimide）（Sigma⁃Aldrich）溶解于1 mL的去离子水中，然后将制备好的磁珠纳米颗粒5 mg加入至上述混合溶液中；30 min后，用去离子水洗两次磁珠纳米颗粒，然后取100 μg／mL的H7N9鼠单克隆抗体M⁃H7N9（上海安研）与磁珠纳米颗粒孵育反应（pH6.0 NaAc溶液，4℃过夜或者37℃1 h）；反应后用PBS清洗两次，最后保存于PBS溶液中.

1.5 免疫磁珠酶催化试纸条的组装免疫磁珠酶催化试纸条的组装依据文献报道［20］，并做了少许改进，具体为：首先将硝酸纤维素膜（Millipore）、吸水垫粘贴于背板（20.0 cm×2.5 cm）上，然后用喷膜机喷涂检测线与对照线.检测线喷涂H7N9兔多克隆抗体R⁃H7N9（上海安研），对照线喷涂羊抗鼠抗体（Sigma⁃Aldrich）.喷涂后放置于37℃干燥1 h，然后采用切条机切成25 mm×5 mm的试纸条，室温干燥保存.

1.6 免疫磁珠酶催化试纸条对H7N9病原体的检测

首先将免疫磁珠抗体探针稀释到1%BSA⁃PBS中，然后取7 μL混合到70 μL梯度稀释的待检测H7N9灭活病毒的培养上清溶液（1∶2，1∶10，1∶100，1∶1000，1∶10000，1∶100000），混合后将制备好的免疫磁珠层析试纸条插入溶液中，层析反应10～15 min后，取出试纸条放入DAB显色液（Sigma⁃Aldrich）中反应3～5 min，观察试纸条T线、C线上的颜色信号，判断检测结果.同时测试胶体金试纸条对H7N9灭活病毒的检测，实验流程同纳米酶试纸条流程.

2 结果

2.1 磁珠纳米颗粒的合成与表征合成的磁珠纳米颗粒粒径均一性较好，大小为200～250 nm（图3）.

图3 磁纳米颗粒电镜表征图

对磁珠纳米颗粒酶活性进行测试，根据OD 652的读值，做出酶活性与所加磁珠纳米颗粒量的对应关系（表1，图4），可以看出，在100 μL反应体系中，当加入4 μg磁珠纳米颗粒时，基本达到最大反应活性，当再增加磁珠纳米颗粒用量时，反应活性增加较少.

表1 磁珠纳米颗粒酶活性测试结果

图4 磁珠纳米颗粒酶活性测试分析

2.2 磁珠纳米颗粒、胶体金试纸条对H7N9的检测结果磁珠纳米颗粒对H7N9灭活病毒最低的检测限为1∶10000～1∶1000（1∶1000时信号非常明显，1∶10000时也可看到检出信号）.当稀释浓度为1∶100000时，不能够检出；而胶体金对H7N9灭活病毒最低的检测限为1∶100，当稀释浓度为1∶1000时，不能够检出，说明磁珠纳米颗粒酶活性试纸条的检测敏感性比胶体金的高出1～2个数量级（图5）.

图5 磁珠纳米颗粒、胶体金试纸条对H7N9的检测

3 讨论

本研究利用磁珠纳米颗粒的酶催化活性，通过酶催化底物形成大量棕褐色沉淀，从而增强检测信号的策略，研发了H7N9病原体的磁珠纳米颗粒酶催化免疫层析试纸条检测方法，实验结果表明免疫磁珠酶催化试纸条的检测敏感性比目前通用的胶体金法高出1～2个数量级，这种新的设计策略为提高免疫层析技术的灵敏度提供了新思路.但本研究所提出的这种新方法仍有改进的地方，比如在免疫层析后，需要将试纸条浸入显色液中反应显色，这个过程如能简化为显色试剂直接滴加到试纸条上则可节约试剂也可节约时间，这也是本研究作者目前正在优化的工作.总体来讲，由于磁珠纳米颗粒制备容易、稳定性好等特点，疫磁珠酶催化试纸条可以被推广为一种通用的检测新技术，这也为流感病毒的快速、高灵敏检测，为我国海关口岸的检验检疫及卫生防控提供了一个新的检测技术平台.

4 致谢

感谢中国科学院生物物理研究所阎锡蕴院士、段德民副研究员在课题实施过程中给予的建议和指导.

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S855.3

A

2095⁃6894（2017）04⁃52⁃04

2016－12－13；接受日期：2016－12－30

国家质量监督检验检疫总局科技计划项目（2015IK319）

刘 键.副研究员.研究方向：传染病检测.

E⁃mail：liuj9919＠163.com