左归丸水煎液对衰老MSCs的影响

丁富平，张 晨，张玉卓，覃星奎，詹 菲，李杰斌，许献光，陈光佩，黄 进，张 进

（1广州中医药大学，广东广州510006；2陕西省安康市中医院，陕西安康725000；3广州卫生职业技术学校，广东广州510450；4广东黄埔卫生职业技术学校，广东广州510720）

·基础与转化医学·

左归丸水煎液对衰老MSCs的影响

丁富平1，张 晨2，张玉卓1，覃星奎1，詹 菲3，李杰斌4，许献光1，陈光佩1，黄 进1，张 进1

（1广州中医药大学，广东广州510006；2陕西省安康市中医院，陕西安康725000；3广州卫生职业技术学校，广东广州510450；4广东黄埔卫生职业技术学校，广东广州510720）

目的：探讨左归丸水煎液对D⁃半乳糖诱导骨髓间充质干细胞（MSCs）衰老模型的影响.方法：分离、培养大鼠MSCs，D⁃半乳糖诱导MSCs建立衰老模型.MTT法检测衰老MSCs活性；流式细胞术比较细胞增殖周期的变化；细胞衰老β⁃半乳糖苷酶染色和吉姆萨染色比较细胞衰老情况.结果：模型组MSCs增殖能力显著低于正常组和左归丸中剂量组，模型组停滞在G1期细胞数目显著高于正常组和左归丸中剂量组，进入DNA快速复制期的细胞显著低于正常组和左归丸中剂量组，模型组细胞衰老β⁃半乳糖苷酶染色阳性率显著高于正常组和左归丸中剂量组.结论：左归丸水煎液在一定程度上可促进衰老MSCs增殖，减少衰老细胞，提示左归丸水煎液对体外培养诱导的衰老MSCs有一定的抗衰老作用.

衰老；骨髓间充质干细胞；左归丸；增殖

0 引言

衰老指机体各器官功能普遍的、逐渐降低的过程.衰老有两种不同情况，一种是正常情况下出现的生理性衰老；另一种是疾病引起的病理性衰老.近年来学术界认为，干细胞衰老是衰老的重要机制，许多研究从干细胞及其微环境角度来进行抗衰老［1－2］.

中医学认为肾精亏虚是衰老的主要原因，而衰老最根本的治疗原则是补肾益精.本团队前期提出假说认为“干细胞具先天之精属性，是先天之精在细胞层次的存在形式”［3－7］.据此，补肾益精方法有可能促进大鼠体外衰老MSCs的增殖能力，从而改善衰老状态.基于干细胞与先天之精的关系，前期研究从中医补肾益精的经典方左归丸入手，结果表明，左归丸可促进衰老大鼠MSCs的增殖［6］，并且能够促进衰老大鼠MSCs的迁移［8］.本研究拟继续探索左归丸水煎剂对MSCs衰老模型的直接作用，以细胞增殖能力显示其抗衰老作用.本研究采用左归丸的水煎液，过滤除菌后直接作用于细胞，观察其对体外培养的MSCs增殖的影响，探索左归丸水煎剂直接作用MSCs抗衰老的影响.把中医药延缓衰老与干细胞研究相结合，从干细胞角度研究补肾益精法抗衰老的作用机理.为深入揭示中医药延缓衰老的机制研究提供创新性思路，为左归丸应用于临床抗衰老的保健与治疗提供有力的实验依据.

1 材料和方法

1.1 动物成年SPF级SD大鼠，雌雄各30只，体质量约300 g，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（粤）2013－0020.

1.2 药物按照《景岳全书》左归丸原方：熟地黄、山药、枸杞子、山茱萸、鹿角胶、龟板胶、菟丝子、川牛膝依次按8∶4∶4∶4∶4∶4∶4∶3比例称量，每份100 g药材.左归丸水提液制备：以上中药加入10倍量的水煎煮2次，90 min／次.将水煎液过滤、旋转蒸发浓缩，最终浓缩为生药浓度为1 g／mL的左归丸水煎液，调整pH7.2，过0.22 μm滤膜除菌，4℃保存备用.用完全培养液［含10%FBS的DMEM（L）培养液］稀释到所需浓度.

1.3 试剂和仪器DMEM（L）培养基（Hyclone，NYH0954）；澳洲特级胎牛血清（Gibco，1478702）；双抗（Gibco，15140122）；胰蛋白酶（Solarbio，20131128），MTT（美国Biomedicals，M6163）；DMSO（美国Biomedicals，61591C）；吉姆萨染色液（广州威佳生物公司，20130608）；细胞衰老β⁃半乳糖染色试剂盒（碧云天生物工程研究所，CO602⁃1）；细胞周期检测试剂盒（碧云天生物工程研究所，C1052）.酶标仪（Bio⁃Rad，美国）；二氧化碳孵育箱（Thermo⁃Fisher，美国）；超净工作台（苏州净化设备厂）；倒置相差显微镜（重庆奥特斯）；流式细胞仪（美国BD公司）.

1.4 方法

1.4.1 实验分组和细胞衰老模型 实验分为正常组、衰老模型组和左归丸水煎液的不同剂量组（低、中、高）.细胞培养到P3代，正常组采用常规培养基培养，其他各组以含D⁃半乳糖（浓度为10 g／L）的完全培养基诱导建立细胞的体外衰老模型［5］.造模成功后，正常组和模型组保持同样的方法培养，左归丸水煎液组（低、中、高）依次采用含0.5、1、2 g／L浓度的左归丸水提取液完全培养基进行培养［9］.

1.4.2 MSCs的培养 将SD大鼠采用颈椎脱臼法处死，无菌条件下取双下肢，去除骨外的各组织，咬断两端的骨骺，用含10%FBS的完全培养基反复冲洗骨髓腔.以4号针头注射液反复抽吸成单细胞悬液，然后接种于25 cm2培养瓶中，置于37℃、5%CO2恒温培养箱中原代培养.2 d后进行首次全换液，以后每3天半换液1次.待细胞铺底达80%～90%，常规按1∶3比例传代培养.采用倒置显微镜密切观察MSCs生长情况及形态变化.

1.4.3 MTT法检测细胞增殖能力 取生长状态良好的P5代MSCs，消化后重悬，制备单细胞悬液，以1×104个／mL密度接种于96孔培养板内，每孔以完全培养基加满至200 μL.左归丸低、中、高剂量组依次加入配好的不同浓度含左归丸水煎液培养基，空白组加含10%FBS完全培养基.各组同时培养1、2、3、4、5天，以后每隔一天取出一个96孔板，每孔加入MTT溶液20 μL（5 mg／mL），继续培养4 h后弃去液体，每孔重新加入DMSO 150 μL，振荡溶解10 min，以490 nm波长测定各孔吸光度值，绘制细胞增殖曲线，每组实验设8个复孔.

1.4.4 细胞Giemsa染色 取各组P5代细胞，将1×104／mL单细胞悬液接种于6孔板中，每孔2 mL，待细胞融合约80%～90%，取出各组6孔板，弃培养基，PBS清洗3遍，4%多聚甲醛固定10 min，弃固定液，PBS洗3次，弃PBS，每孔滴加Giemsa染色工作液1 mL进行染色5 min，水洗30 s，待干后高倍镜下观察细胞形态.

1.4.5 细胞衰老β⁃半乳糖苷酶染色 取各组P5代细胞，将1×104／mL单细胞悬液接种于6孔板中，每孔2 mL，待细胞融合约80%～90%，取出各组6孔板，弃培养基，PBS清洗3次，加入l mL β⁃半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15 min，弃固定液，PBS洗3次，每次3 min，弃PBS，每孔加入β⁃半乳糖苷酶染色工作液（β⁃半乳糖苷酶染色A液10 μL，β半乳糖苷酶染色B液10 μL，β半乳糖苷酶染色C液930 μL，X⁃Gal溶液50 μL），封口膜封边，37℃孵育过夜.普通光学显微镜下观察.

1.4.6 各组MSCs细胞周期分析 收集各组P5代MSCs约2×106个，PBS洗2次，离心，弃上清液，缓慢向细胞沉淀中滴加1 mL、－20℃预冷的70%冰乙醇，4℃固定过夜，离心，去上清液，PBS洗涤2次，0.5 mL PBS重悬细胞，加入1 mg／mL RNaseA 200 μL，37℃水浴30 min，离心去上清，加入5 mg／L的碘化丙啶1 mL，4℃避光染色30 min，流式细胞仪检测.

2 结果

2.1 细胞增殖生长曲线连续6 d测每组细胞吸光度OD值，并绘制生长曲线（图1）.细胞衰老模型组，平均OD值显著低于正常组，差异有统计学意义（P＜0.01）.第1天各组吸光度无显著差异；第2天，左归丸高剂量组OD值显著高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；第3天，中剂量组吸光度OD值均显著高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；第4、5、6天，中剂量组吸光度OD值显著高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.01，图1）.

图1 细胞生长曲线

2.2 Giemsa染色观察细胞形态给予成年大鼠腹腔注射10%D⁃半乳糖60 d，建立亚急性衰老大鼠模型.倒置荧光显微镜下观察各组细胞形态.正常组细胞生长良好，细胞呈梭形漩涡状生长，胞核呈规则圆形；与正常组比较，模型组细胞生长缓慢，细胞较大，胞核不规则，胞质可见颗粒状物质，并见不同程度的细胞膜破裂；与模型组比较，左归丸中剂量组细胞生长较好，胞核大部分呈规则分布，胞核可见少量颗粒状物质，未见明显细胞膜破裂（图2）.

图2 细胞吉姆萨染色

2.3 细胞衰老β⁃半乳糖苷酶染色衰老模型组细胞染色阳性率明显高于正常组和左归丸低、中、高剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05，表1、图3）.

表1 细胞衰老β⁃半乳糖苷酶染色阳性率（%）

表1 细胞衰老β⁃半乳糖苷酶染色阳性率（%）

aP＜0.05 vs正常组；cP＜0.05 vs模型组.

图3 细胞衰老β⁃半乳糖苷酶染色

2.4 各组细胞周期分析衰老模型组细胞在G1期占百分率显著高于正常组和左归丸中剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05）；衰老模型组细胞在S和G2期占百分率显著低于正常组和左归丸中剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05，图4）.

图4 各组细胞增殖周期

3 讨论

干细胞（stem cell，SC），是一种在人体生长、发育和生殖过程中起始动作用的原始细胞，它具备高度的自我更新和多向分化潜能的细胞群体［10］.骨髓间充质干细胞是一种来源于中胚层的多能干细胞，具备极强的自我更新和多向分化潜能，普遍存在于全身各组织器官中，以骨髓中数量较为丰富.但是，MSCs在骨髓中的数量也很有限，大约每10－4～10－5个单核细胞中只含有1个MSCs.MSCs虽然数量极少，但是其易于分离、培养，且增殖能力极强.现代医学研究认为，干细胞的生存状态决定着机体的生长、发育和生殖状态.干细胞调控机体的生、长、壮、已，决定了机体的生长状态.回顾性研究［11］表明，干细胞数量减少、周围微环境的变化以及定向分化能力的改变都可能导致机体功能状态逐渐衰减，诱发机体衰老.通过药物诱导干预，调节干细胞生存的微环境，有可能减缓或逆转衰老的进程.干细胞移植、静脉输注，可以增加干细胞的数量；尚有研究表明［12］，尾静脉注射干细胞能够增强衰老大鼠抗氧化能力和免疫活性，从而逆转衰老.崔渊博等［13］发现干细胞移植能够改善衰老模型大鼠肾、肺组织中衰老蛋白的表达，这些研究提示，干细胞可能是防止衰老的重要屏障，是决定人体衰老与否的重要因素.

研究发现［14－16］补肾类方能够促进MSCs增殖和迁移，动员自身MSCs，提高外周血MSCs数量.综上研究说明，补肾益精法能够促进MSCs增殖，抑制MSCs的衰老进程，延缓衰老的发展.本研究选择左归丸水煎液进行体外干预MSCs，观察对衰老MSCs的增殖效应，并初步探讨抗衰老的机制.谭峰等［8］用左归丸和右归丸的水提取液分别对rMSCs进行干预，发现左归丸的促增殖作用最强.补肾益精作用较弱的六味地黄丸、肾气丸也有促进MSCs增殖的趋势.左归丸作用强于右归丸，说明对衰老的干细胞，补肾精作用强于补肾阳的作用，这就反证了MSCs是先天之精的一种表现形式，为“干细胞具先天之精的属性”理论假说提供了证据.

MSCs虽然具备强大的增殖潜能，但是通常情况下处于静息状态，只有受信号因子刺激，细胞才能被活化，进入细胞周期，参与细胞周期，影响细胞的增殖、分化、迁移和归巢等.本实验表明，左归丸促进衰老MSCs增殖，延缓衰老.通过MTT法观察细胞增殖效应，细胞培养第2天开始，衰老组的吸光度增加幅度不及正常组，增殖呈现抑制状态.左归丸干预后，MSCs的活性明显增加，尤其是中剂量组的吸光度较其它给药组大，细胞数量显著增多.随后的连续4天，左归丸对衰老细胞呈现促增殖状态.而且低和高剂量组明显不及中剂量，考虑低剂量的浓度太小，只表现增殖的趋势，高剂量浓度过高，可能产生了细胞毒性，因此促增殖作用不明显.

D⁃半乳糖诱导衰老模型在体内［17］或者体外［18］均是比较公认的造模方式，正常组大鼠MSCs多呈梭形，胞浆丰富，染成紫蓝色，细胞核染成深蓝色，有一两个核仁，核仁明显.造模成功后，模型组MSCs见多边形、方形，胞浆内部颗粒物质增多，细胞核染成深蓝色，有一两个核仁，核仁明显.经左归丸干预治疗后MSCs呈梭形，胞浆丰富，染成紫蓝色，细胞核染成深蓝色，有一两个核仁，核仁明显.且左归丸水煎剂中剂量组细胞接近正常组细胞形态，效果最好.这表明左归丸水煎剂在一定剂量及时间内有抗衰老的作用.

有研究表明衰老细胞通常体积变大，表达pH 6.0时有高酶活性的β⁃半乳糖苷酶［19］.细胞衰老β⁃半乳糖苷酶染色试剂盒仅染色衰老细胞，因此，本研究选β⁃半乳糖苷酶染色试剂盒比较各组大鼠MSC细胞衰老的情况.结果显示：模型组衰老细胞阳性率最高，明显高于正常组和左归丸中剂量组.这表明衰老细胞模型成立，经左归丸水煎液干预治疗后，衰老细胞数量明显减少，左归丸水煎液在一定浓度有抗衰老的作用.

细胞周期结果反映细胞增殖周期中DNA的复制和蛋白的表达状态.已有研究表明［20］，衰老大鼠中处于G1期的BMSCs比例增高、S期细胞比例降低.本实验采用D⁃半乳糖直接干预MSCs，衰老细胞增殖周期停滞于G1期，DNA复制和蛋白表达受到明显的限制.左归丸刺激细胞后，细胞周期被激活，快速进入DNA复制和蛋白的表达，完成细胞有丝分裂过程，表现出促增殖效应.MSCs衰老在形态学观察显示，衰老细胞形态不同于正常组，细胞呈扁平、核大、颗粒物质增多、容易被半乳糖苷酶染色.通过抗衰老干预后，细胞形态接近正常.综上所述，补益肾精经典方左归丸能够缓解MSCs的衰老状态，这表现在细胞数量的增加、细胞形态趋于正常改变、细胞快速进入DNA对数复制期以及蛋白高表达.

本次探索性实验研究表明，体外诱导的衰老MSCs增殖能力减弱，左归丸水煎剂能够促进衰老MSCs的增殖能力，结果显示左归丸水煎剂中剂量组具有较好的干预效果.研究结果在一定程度上佐证了“干细胞与先天之精相关的理论假说以及进一步提出肾精亏虚即为干细胞衰老是人类衰老的根本所在”理论假说的科学性.

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Effects of Zuogui Pill water decoction on ag⁃ing bone marrow mesenchymal stem cells

DING Fu⁃Ping1，ZHANG Chen2，ZHANG Yu⁃Zhuo1，TAN Xing⁃Kui1，ZHAN Fei3，LI Jin⁃Bin4，XU Xian⁃Guang1，CHEN Guang⁃Pei1，HUANG Jin1，ZHANG Jin1

1Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China；2Hospital Of Traditional Chinese Medicine of Ankang，Ankang 725000，China；3Health Science College of Guangzhou，Guangzhou 510405，China；4Health Science College of Huangpu，Guangzhou 510720，China

AIM：To investigate the effect of Zuogui Pill water decoction on bone marrow mesenchymal stem cell（MSCs）aging model induced by D⁃galactose.METHODS：MSCs was isolated and cultured，and ageing cell model was builded by D⁃galactose induced MSCs.Activity of MSCs was observed by MTT，and change of cell proliferate cycle was compare by flow cytometry.Condition of cell aging was compared by β－galactosidase staining and giemsa staining of senescent cells.RESULTS：The prolifera⁃tion capacity of MSCs in model group was significantly lower than those of Zuogui Pill groups and normal group；Cell number of MSCs stagnated in the G1 phase in model group was significantly higher than those of Zuogui Pill groups and normal group；Cell number of MSCs entering the period of DNA rapid replication was lower than those of Zuogui Pill groups and normal group；Positive rate of β⁃galactosidase staining aging cells in model group was higher than Zuogui Pill groups and normal group.CONCLU⁃SION：Zuogui Pill water decoction can improve the proliferation ability of ageing rat MSCs and reduce the number of aging MSCs in some degree，which shows Zuogui Pill water has the effect of anti⁃aging.

aging；MSCs；Zuogui Pill；proliferation

R285.5

A

2095⁃6894（2017）04⁃11⁃04

2016－12－05；接受日期：2016－12－22

国家自然科学基金项目（81202732）；广州中医药大学科研创新团队项目（2016KYTD10）

丁富平.硕士，副教授.研究方向：女性衰老的生理、心理及

中医药防治.Tel：020⁃39358373 E⁃mail：hldfp＠gzucm.edu.cn

张 晨.硕士.研究方向：干细胞与中医再生医学.E⁃mail：904686561＠qq.com（共同第一作者）

张 进.博士，副教授.研究方向：干细胞与中医再生医学.

Tel：020⁃39358001 E⁃mail：zhjin＠gzucm.edu.cn