双去甲氧基姜黄素与姜黄素纳米乳药代动力学的比较研究

陈 静， 杨 梅，2， 张景勍， 蒋心惠， 胡雪原*

（1.重庆医科大学 药物高校工程研究中心，重庆400016；2.重庆市长寿区中医院，重庆401220）

双去甲氧基姜黄素与姜黄素纳米乳药代动力学的比较研究

陈 静1， 杨 梅1，2， 张景勍1， 蒋心惠1， 胡雪原*1

（1.重庆医科大学 药物高校工程研究中心，重庆400016；2.重庆市长寿区中医院，重庆401220）

制备并考察双去甲氧基姜黄素纳米乳和单体姜黄素纳米乳的药代动力学特征。雄性SD大鼠口服灌胃分别给予双去甲氧基姜黄素纳米乳和单体姜黄素纳米乳后，于大鼠眼底静脉丛取血，采用HPLC法测定血浆中单体双去甲氧基姜黄素和姜黄素的浓度，DAS 2.1.1药动学软件计算药动学参数。得到双去甲氧基姜黄素纳米乳和单体姜黄素纳米乳主要药动学参数Tmax为1.50 h和1.00 h；Cmax为（85.87±2.53）和（85.60±2.30）μg/L；AUC0~72h为（788.23±52.04）和（1 345.50± 64.88）μg/L·h。表明姜黄素纳米乳的口服生物利用度比双去甲氧基姜黄素纳米乳更好。

双去甲氧基姜黄素；姜黄素；纳米乳；药代动力学

姜黄素是从姜科植物姜黄的根茎中提取得到的一种天然的可食用黄色素，已成为国内外广泛使用的7个天然色素品种之一，是联合国粮农组织（FAO）专家委员会和世界卫生组织（WHO）批准的一种食品添加剂，广泛应用于食品加工领域[1]。姜黄素具有广泛的药理作用，主要有抗癌[2]、抗氧化[3]、抗炎等活性。双去甲氧基姜黄素 （bisdemethoxycurcumin，BC）是姜黄素（curcumin，CC）的天然衍生物，与CC具有相同的母核结构，唯一的区别在于BC的两个甲氧基被取代[4]，两者具有多种相似的药理活性。相较于CC、去甲氧基姜黄素（demethoxycurcumin，DC），双去甲氧基姜黄素是对人类醛-酮还原酶1B10（AKR1B10）选择性最高、效力最强的竞争性抑制剂[5]，同时据报道，相较于姜黄素，双去甲氧基姜黄素能提高核细胞摄取和增加稳定性[6]，表明双去甲氧基姜黄素是一种有良好发展前景的抗癌药物，其水溶性差，生物利用度低[7-8]。

纳米乳（nanoemulsion，NE）又称微乳，作为一种新型的药物载体，它具有以下优点：毒性小、安全性高、制备简单，可增大难溶于水药物的溶解性[9-10]，将BC和CC分别制成纳米乳以克服其水溶性差、生物利用度低的缺点。目前对单体BC和CC纳米乳制剂的文献报道甚少，因此作者将单体BC和CC分别制成纳米乳，并对两者的理化性质、体外释放行为、药代动力学特征进行对比研究，为临床药效学的深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与设备 Agilent 1100液相色谱仪：美国Agilent公司产品；Hypersil ODS色谱柱：大连依利特分析仪器有限公司产品；TGL-16G高速台式离心机：上海安亭科学仪器厂产品；分析电子天平：AB204-E，瑞士Mettler Toledo公司产品；旋涡混合器：QL-901，海门其林贝尔仪器公司产品；RE-52AA型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂产品；激光粒度仪：英国Malvern公司产品；Milli-Q Biocel A-10超纯水制备系统：美国Millipore公司产品。

1.1.2 药品与试剂 双去甲氧基姜黄素 （纯度＞99%）：实验室自制；姜黄素（纯度＞99%）：实验室自制；尼群地平（纯度99．5%）：陕西师诺生物科技有限公司产品；油酸乙酯（AR）：上海化学试剂二厂产品；聚氧乙烯蓖麻油（AR）：德国BASF公司产品；聚乙二醇（AR）：天津精细化工有限公司产品；维生素E聚乙二醇琥珀酸酯（AR）：成都艾科试剂化学技术有限公司产品；乙腈为色谱纯；乙醇、乙酸乙酯、冰醋酸等均为分析纯。

1.1.3 实验动物 雄性健康SD大鼠12只，体重（250±20）g，由重庆医科大学实验动物中心提供，许可证号：CQLA（渝）2012-1003。

1.2 方法

1.2.1 BCNE和CCNE的制备 分别精密称取处方量的油酸乙酯、聚氧乙烯蓖麻油、聚乙二醇、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯，于恒温40℃搅拌溶解后，加入BC 25 mg，待药物溶解后，将处方量的水缓慢滴加油相中并维持恒速搅拌，即制备得澄清透明淡黄色的BCNE。同法制备CCNE。

1.2.2 BCNE和CCNE的理化性质 采用马尔文粒径测定仪测定BCNE和CCNE的平均粒径和Zeta电位，并用葡聚糖凝胶法测定BCNE和CCNE的包封率。

1.2.3 BCNE，CCNE体外释放行为的考察 采用动态透析法考察BCNE，CCNE的体外释药行为，分别以含体积分数20%乙醇和质量分数0．5%SDS的pH1．2的HCl溶液（0．1 mol/mL）和pH6．8的磷酸盐缓冲液为释放介质，释放介质体积为100 mL，分别取BCNE和CCNE置于透析袋中，密闭置于恒温水浴震荡器中，在37℃下，以100 r/min的速度搅拌。分别于 1、2、4、6、8、10、12、24、48、72、96、120、144、168 h取出1 mL释放介质，同时补充等温等体积的释放介质。测定所取样品的BC和CC质量分数。

1.2.4 血浆样品的采集 取健康雄性SD大鼠12只，体重（250±20）g，随机分为两组，每组6只，分别灌胃给予BCNE和CCNE混悬液（相当于给药量BC与CC 50mg/kg）。给药前禁食12 h，自由饮水。分别在给药后5，10，15，30，45 min，1 h，1．5 h等时间点于大鼠眼底静脉丛取血，肝素化后6 000 g离心10 min，吸取上清液，置于-20℃冰箱冷藏保存备用。

1.2.5 色谱条件[11]BC色谱条件：Hypersil ODS色谱柱（250 mm×4．6 mm，5μm），流动相：V（乙腈）∶V（体积分数5%冰醋酸溶液）=45∶55，流量：1mL/min，柱温：30℃，测定波长：417 nm，内标：尼群地平，进样量：20μL。

CC色谱条件：Hypersil ODS色谱柱 （250 mm× 4.6mm，5μm），流动相：V（乙腈）∶V（体积分数5%冰醋酸溶液）=45∶55，流量：1mL/min，柱温：30℃，测定波长：426 nm，内标：尼群地平，进样量：20μL。

1.2.6 血浆样品预处理 取血浆样品200μL于2 mL离心管，加入内标尼群地平工作液100μL，再加入乙酸乙酯1.0 mL，漩涡2 min后，12 000 g离心10min，转移上层有机相于另一离心管中，用氮气吹干仪吹干。最后用100μL流动相复溶，取复溶液20μL进样检测。

1.2.7 方法学考察

1）方法专属性 在此样品处理方法和色谱条件下，测定空白血浆、空白血浆+对照品+内标、血浆样品，考察方法的专属性。

2）标准曲线的建立 分别精密称取BC 10.0 mg、CC 10.0mg、内标尼群地平（NT）5.0 mg，用少量甲醇溶解后，转移移至100mL棕色容量瓶中定容，摇匀即得BC工作溶液100μg/mL、CC工作溶液100μg/mL、尼群地平内标工作液100μg/mL，于4℃冰箱保存。临用时吸取BC、CC工作溶液适量用甲醇稀释成质量浓度为0.5μg/mL对照品溶液。

取200μL空白血浆于2 mL离心管中，加入适量BC（500 ng/mL）对照品溶液，再加入100μL尼群地平工作液， 制备 BC质量浓度为15，70，105，140，175，210，245 ng/mL的标准系血浆样品。按照“1.2.6”项下处理后进样分析，得BC的标准曲线。同法操作得到CC的标准曲线。

3）精密度实验 取200μL空白血浆，分别精密加入BC或CC对照溶液使其配成70、140、210 ng/mL的低、中、高3种质量浓度的标准血浆样品各5份，按“1.2.6”项下样品预处理方法，在“1.2.5”项色谱条件下，于一日内各测定5次，计算3种浓度的日内精密度；同一条件下每日测定一次，连续测定5天，计算3种浓度的日间精密度。

4）回收率实验：取200μL空白血浆，分别精密加BC或CC对照溶液配制质量浓度为70、140、210 ng/mL的标准血浆样品各3份，按“1.2.6”项下处理后进样分析。按标准曲线计算血浆中BC或CC的质量浓度，以测定浓度与实际浓度的比求平均回收率。1.2.8 数据处理方法 采用DAS2.1.1软件对CCNE和BCNE血药浓度-时间曲线进行非室模型（统计矩）拟合，得到药代动力学参数。其中Cmax为给药后的最大血药浓度，Tmax为给药后血药浓度达峰时间，MRT为体内平均滞留时间，CL为清除率，血药浓度-时间曲线下面积AUC（0-t）由梯形法计算得到。

2 结果与分析

2.1 BCNE，CCNE粒径、Zeta电、包封率测定结果

通过马尔文粒径测定仪测定BCNE和CCNE的平均粒径、Zeta电位、包封率分别为35.2 nm和32.37 nm，-2.39mV和-6.0mV，91.39%和91.25%。

2.2 BCNE，CCNE体外释放行为结果

由图1可知，BCNE与CCNE有相似的体外释放曲线。

相似因子f2由Moore和Flanner首先提出[12]，被FDA推荐为比较两条溶出曲线相似性的首选方法[13]，其数学表达式为：

式中，f2为相似因子；为t时间参比制剂的累积释放百分率；为t时间时受试制剂累积释放百分率；n为有效取样点个数，为权重，作者设为1。当f2值介于0~50之间时，即可认为两条曲线有显著性差异；介于50~100之间时，即说明两条曲线为无显著性差异；f2值越接近100，相似程度也就越高。将实验得到的释放曲线使用上述公式进行两两拟合，计算得到相似因子f2，结果见表1。在不同pH时，BCNE与CCNE释放曲线之间的相似因子均大于50，说明BCNE与CCNE体外释放曲线无显著性差别。

图1 BCNE和CCNE在释放介质为pH 1.2及pH 6.8时的体外释放行为Fig.1 Release of BCNE and CCNE in releasemedium of pH 1.2 and pH 6.8

表1 BCNE和CCNE释药曲线拟合方程Table 1 Release patterns of sustained release BCNE and CCNE

2.3 方法学考察

2.3.1 方法专属性 在此样品处理方法和色谱条件下，分别测定空白血浆、空白血浆+对照品+内标、血浆样品，测定得到CC和内标NT的保留时间分别为9.35 min和11.84 min，BC和内标NT的保留时间分别为5.51min和9.24min，CC和内标NT与BC和内标NT具有良好的分离效果，血浆中的内源性物质在CC、BC、NT的出峰位置无干扰。

2.3.2 标准曲线的建立 以BC与尼群地平的峰面积比（Y）对BC浓度（C）线性回归，得回归方程为：Y=0.012 8X+0.211（r=0.999 6）。同理可得CC的线性回归方程为：Y=0.022 5X+0.006 2（r=0.999 8）。BC和CC质量浓度在15～245 ng/mL范围内与峰面积的线性关系良好。

2.3.3 精密度实验 测定得到CC的日内精密度的RSD分别为1.73%，1.51%，1.42%（n=5），BC的日内精密度的RSD分别为2.14%，1.86%，1.28%（n=5）；CC的日间精密度的RSD分别为 2.46%，1.95%，1.76%（n=5），BC的日间精密度的 RSD分别为1.97%，2.26%，1.64%（n=5）。符合生物样品分析方法的测定要求。

2.3.4 回收率实验 测定得到CC的平均回收率分别为：99.37%、99.75%和99.84%，BC的平均回收率分别为：99.22%、99.75%和99.84%，表明本方法回收率符合含量测定方法要求。

2.4 血药浓度和药动学参数

分别以BC和CC的血药浓度为纵坐标，时间t为横坐标作图，得到血药浓度-时间曲线，大鼠灌服BCNE和CCNE的平均血药浓度-时间曲线见图2。药动学数据采用DAS2.1.1软件对所得实验数据进行非房室模型（统计矩）拟合，BCNE和CCNE主要药动学参数见表2。由表2可知，CCNE与BCNE的AUC0~72h分别为（1345.50±64.88）和（788.23±52.04）μg/L·h，CCNE的 AUC0~72h是 BCNE的 1.71倍；CCNE与 BCNE的 Tmax分别为 1.00 h和 1.50 h，CCNE的Tmax是BCNE的0.67倍；两者的Cmax分别为（85.60±2.29）和（85.87±2.53）μg/L，经t检验无统计学差异。

图2 大鼠灌胃BCNE和CCNE后的血药浓度曲线（n=6）Fig.2 M ean plasma concentration-time profiles of BCNE and CCNE after oral adinistration in rats（n=6）

表2 SD大鼠口服BCNE和CCNE混悬液的主要药动学参数Table 2 M ain pharmacokinetic parameters of SD rats after oral adm inistration of BCNE and CCNE suspensions

3 结语

姜黄色素在水中的溶解度低，血浆半衰期很短，口服不易吸收，生物利用度低，张立康经实验证实了口服姜黄素生物利用度低[14]。针对药物的难溶性，有相关文献报：Francis等将BC模拟纳米粒增加其抗癌和抗氧化活性[15]；朱光宇将BC制备成滴丸提高其生物利用度[16]；尤佳等将CC制备成循环脂质体延长其在体内的作用时间[17]。作者将BC和CC制备成纳米乳，提高药物的口服吸收率及生物利用度。

药动学结果表明，CCNE的Tmax、MRT0~72h、CL分别是BCNE的0.67倍、1.14倍、0.39倍，说明CCNE较BCNE的达峰时间短，体内吸收快，清除率低，药物在体内循环的时间更长。CCNE的AUC0~72h分别是BCNE的1.71倍，表明CCNE较BCNE有更高的生物利用度，而较钟荣玲课题组按300 mg/kg灌胃给予姜黄素纳米乳混悬剂的AUC0-t（5 050.2.6±3 290.9）μg/L·h有较大的提高[18]，可能是单体姜黄素较总姜黄素有更高的生物利用度，具体机制还有待进一步考察。将BC和CC制备成纳米乳，CCNE较BCNE的体内吸收快，清除率低，药物在体内作用的时间更长，生物利用度更高。

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Com parative Pharmacokinetic Study of BCNE and CCNE

CHEN Jing1， YANGMei1，2， ZHANG Jingqing1， JIANG Xinhui1， HU Xueyuan*1
(1.Medicine Engineering Research Center，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；2. Chongqing Changshou Medicine Hospital，Chongqing 401220，China）

Bisdemethoxycurcum in nanoemulsion（BCNE）and curcum in nanoemulsion（CCNE）were prepared and their pharmacokinetics was evaluated.Plasma sampleswere collected from the retinal venous plexus of SD rats after oral adm inistration of BCNE and CCNE.The concentration of BC in plasmawas determined by HPLC.The pharmacokinetic parametersof BCNE and CCNEwere calculated w ith DAS2.1.1 pharmacokinetic program.Tmaxof BCNE and CCNEwere 1.50 h and 1.00 h，while Cmaxwere 85.87±2.53μg/L and 85.60±2.29μg/L.AUC0～72hfor BCNE and CCNE were 788.23±52.04μg/L·h and 1345.50±64.88μg/L·h，respectively.The oral bioavailability of CCNE exhibited better performance than thatof BCNE.

bisdemethoxycurcum in，curcum in，nanoemulsion，pharmacokinetics

TS 202.3

A

1673—1689（2017）04—0420—05

2015-05-11

重庆市自然科学基金重点项目（CSCT2012JJB10027）；重庆市教委科研项目（KJ120321）。

*通信作者：胡雪原（1971—），女，重庆人，副教授，硕士研究生导师，主要从事新药研究与开发。 E-mail：xueyuanhu96@126.com

陈静，杨梅，张景勍，等.双去甲氧基姜黄素与姜黄素纳米乳药代动力学的比较研究[J].食品与生物技术学报，2017，36（04）：420-424.