pH响应型透明质酸-棉酚纳米粒子的制备及其性能研究

施 瑜， 王丽娟， 徐珊珊， 刘 潇， 许菲格，张曼悦， 朱栋琪， 陈荆晓， 陈敬华

（江南大学 药学院，江苏 无锡214122）

pH响应型透明质酸-棉酚纳米粒子的制备及其性能研究

施 瑜， 王丽娟， 徐珊珊， 刘 潇， 许菲格，张曼悦， 朱栋琪， 陈荆晓， 陈敬华*

（江南大学 药学院，江苏 无锡214122）

制备了基于硼酸酯键的pH响应型透明质酸-棉酚缀合物，用于治疗前列腺癌。其在水溶液中可自组装形成纳米粒子，透射电镜观测表明其平均粒径40 nm，可均匀分散。体外药物释放实验证明，其具有pH响应的释药行为。体外细胞毒性结果显示其对前列腺癌细胞的半数抑制浓度（IC50）较正常细胞低，表现出治疗靶向性。该纳米粒子在棉酚的靶向传递及前列腺癌治疗方面具有一定的应用潜力。

pH响应；硼酸酯键；棉酚；纳米粒子；细胞毒性

前列腺癌是常见的老年男性癌症，随着人口老龄化其发病率日趋增高[1-2]。棉酚（Gossypol，GP）这种常用作避孕药的天然化合物可直接作用于前列腺，具有抑制前列腺癌细胞增殖、促其凋亡的作用[3-4]。不过，棉酚水溶性不佳，且不具有选择性易产生副作用而应用受限。由于肿瘤组织具有pH偏低的性质，用具有pH响应功能的纳米药物传递系统能提高疏水性药物的生物利用度，同时改善其靶向治疗效果[5]。因而，构建新型pH敏感药物传递系统受到研究人员的关注。

有研究表明，苯硼酸在pH大于其pKa时，可与具有二醇结构的化合物结合形成硼酸酯键，当介质pH小于pKa时，硼酸酯键则会断裂，表现出pH响应行为[6-8]。由于GP分子具有邻二醇基团，可利用其与苯硼酸形成硼酸酯键，制备受pH调控的GP药物传递系统。透明质酸（Hyaluronic acid，HA）作为天然大分子，其生物相容性良好并可特异性识别肿瘤细胞表面过量表达的CD44受体[9-11]，因此可构建基于HA的药物传递系统来改善GP的生物相容性并提高其肿瘤靶向性。

作者拟在透明质酸分子上连接氨基苯硼酸（3-aminophenylboronic acid，APBA），得到衍生物HP，之后通过硼酸酯键与GP连接，制备具有两亲性的HGP缀合物（如图1）。期望HGP在水溶液中能自组装形成纳米粒子，并利用HA可特异性识别肿瘤细胞表面过量表达CD44受体以及硼酸酯键的pH响应性质，实现GP的靶向传递和控制释放。

图1 HGP的合成路线Fig.1 Synthetic route of HGP

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

棉酚由江南大学药学院汤鲁宏教授赠予；HA（M w 5 000）：购自山东福瑞达医药集团公司；APBA：购自上海安耐吉化学有限公司；噻唑蓝（MTT），N，N’-二异丙基碳二亚胺（DIC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）：购自上海晶纯试剂有限公司；透析袋、胰酶：购自Sigma-Aldrich公司；青霉素-链霉素，RPMI 1640，DMEM 细胞培养基：自 Life Technologies公司；胎牛血清（FBS）：购自Hyclone公司；其它试剂均为分析纯，使用前纯化。

1.2 主要仪器

Avance III型核磁共振波谱仪：德国Bruker公司产品；JEM-2100透射电镜：日本JEOL公司产品；Zetasizer Nano ZS电位及粒度分析仪：英国Malvern公司产品；Multiskan GO酶标仪：美国Thermo公司产品。

1.3 菌株与细胞株

人前列腺癌细胞（PC-3），非洲绿猴SV40转化的肾细胞（COS7）：购自中国科学院保藏中心（上海）。

1.4 实验方法

1.4.1 HP的制备 将100 mg的HA（0.248 mmol双糖单元）溶于10 mL新蒸甲酰胺中，加入0.12mLDIC（0.75 mmol，3 eq）和87.5 mg NHS（0.75 mmol，3 eq），于冰浴下活化羧基2 h，之后将50mg APBA（0.38mmol，1.5 eq）加入上述溶液，氮气保护下反应48 h。反应结束后，用V（醋酸缓冲溶液）∶V（甲醇）= 1∶1透析2 d，之后用去离子水透析2 d，冷冻干燥得HP。产物通过核磁共振氢谱（1H NMR）确认结构。

1.4.2 HGP的制备 称取50 mg的HP溶于5 mL PBS（pH 7.4），将2mLGP的甲酰胺溶液 （10mg/ mL）缓慢滴加入上述溶液，并于室温下搅拌6 h。反应结束后用V（PBS）∶V（甲醇）=1∶1透析1 d，之后用PBS（pH 7.4）透析1 d，冷冻干燥得HGP。产物通过核磁共振氢谱（1H-NMR）确认结构，并根据GP标曲测定其含量。GP质量分数（%）=（mGP/mHGP）×100%。1.4.3 HGP纳米粒子的制备及表征 将HGP溶于PBS（pH 7.4，1 mg/mL）中，于25℃下静置1 h，待纳米粒子形成并稳定后测定其粒径分布和ζ-电位，并通过透射电子显微镜观测其形貌。

1.4.4 体外药物释放实验 采用透析法测定GP的释放行为，将2mL HGP（1 mg/mL）溶液装入透析袋中，然后分别浸入装有10mL不同pH（pH 5.0和pH 7.4）的缓冲溶液中，放入摇床，37℃条件下于预设时间取样，同时补充新鲜缓冲液。用紫外分光光度计于368 nm处测样品紫外吸收，并根据GP标曲计算累积释放率，每组实验3个平行。药物累积释放率（%）=（Mt/M）×100（Mt为t时刻GP的累积释放量；M为HGP中GP总质量）

1.4.5 体外细胞毒性实验 PC-3细胞用含质量分数10%FBS、1%双抗的RPMI 1640细胞培养基，COS7细胞用含质量分数 10%FBS、1%双抗的DMEM细胞培养基，在37℃下，含体积分数5% CO2及饱和湿度的培养箱中培养。

待细胞长满后，按8 000个/孔的细胞密度，将细胞接种于96孔板同时培养过夜。之后弃去培养基，将不同浓度的HP、HGP、GP（溶于含质量分数10%FBS的细胞培养基中，其中GP用质量分数5%的DMSO助溶）溶液加入孔板中，并预留只含10% FBS的细胞培养基作为空白对照。继续培养48 h后每孔加入0.5mg/mLMTT溶液100μL，37℃培养4 h，吸出上清液，用100μL DMSO溶解沉淀物，采用酶标仪于570 nm处检测OD值。细胞存活率（%）=（OD加药组/OD空白组）×100

2 结果与分析

2.1 HGP的合成

HP以及HGP的化学结构通过核磁共振氢谱进行确认，结果如图2所示。从HP的核磁图谱可以看出，在7.3×10-6~8.0×10-6处出现了APBA苯环上氢的峰，这说明APBA成功与HA相连，并且通过其与2.1×10-6处的N-乙酰氨基葡萄糖单元上甲基氢峰面积比较，算出APBA的取代度为28%。另外，HGP的核磁图谱在10.2×10-6处出现了GP醛基上氢的峰，同样通过其与2.1×10-6处的N-乙酰氨基葡萄糖单元上甲基氢峰面积比较，可以算出GP的取代度为10%。此外通过368 nm处GP的标曲计算得到的GP质量分数为11.2%，与积分计算所得结果相吻合。

图2 HP（a）与HGP（b）在D2O/CD3OD（体积比为1/1）中的核磁共振氢谱Fig.21H NMR spectra of HP（A）and HGP（B）in D2O/ CD3OD（1/1）

2.2 纳米粒子的表征

将疏水性药物GP连接于HA亲水性骨架上，得到的HGP具有两亲性，因而其在水溶液中能够自组装形成纳米粒子。通过透射电镜观察其形貌（图3），所形成的纳米粒子均匀分散，具有球形结构，粒径约为40 nm。此外，通过动态光散射测定纳米粒子在水溶液中的粒径分布及ζ-电位（如图4），其平均粒径为60.5 nm，比由电镜观测得到的粒径略大，这主要是因为电镜观察的纳米粒子是在干燥状态下，因而尺寸略小。另外测得的ζ-电位值为-13.6 mv，这说明该纳米粒子具有良好的稳定性。

图3 HGP纳米粒子的透射电镜图Fig.3 TEM image of HGP nanoparticles

图4 HGP纳米粒子的粒径分布及ζ-电位Fig.4 Size distribution andξ-potential of HGP nanoparticles

2.3 体外药物释放

HGP在pH 7.4和pH 5.0条件下的药物释放结果如图5所示。在pH 5.0条件下，GP具有较快的释放速率，在开始4 h内可达32%，12 h后累积释放量为60%。而在pH 7.4条件下，GP释放缓慢，12 h内的积累释放量仅有24.2%，3 d后也只达到了28.5%。这主要是因为在pH 5.0环境下，硼酸酯键不稳定，GP与HA的结合发生破坏，随即导致纳米粒子解离，加快了药物的释放。这一结果证明了HGP受pH调控，可在酸性环境下实现GP的刺激-响应释放。

图5 HGP在pH 7.4和pH 5.0环境下的体外药物释放（n=3）Fig.5 In vitro drug release profiles of HGP at pH 7.4 and pH 5.0（n=3）

2.4 HP和HGP的细胞毒性

通过MTT法测定HP对PC-3细胞和COS7细胞的细胞毒性，结果如图6所示。HP对PC-3细胞和COS7细胞均没有表现出明显的细胞毒性，当HP浓度达到300mg/L的情况下，细胞存活率依然维持在80%左右。这一结果说明HP维持了HA良好的生物相容性，可以作为GP的载体用于传递药物。

图6 HP对PC-3细胞和COS7细胞48 h的体外细胞毒性（n=6）Fig.6 In vitro cytotoxicity of HP against PC-3 and COS7 cells after 48 h（n=6）

GP和HGP的细胞毒性同样通过MTT法测定，结果如图7所示，GP对PC-3细胞和COS7细胞均有较大的毒性，其半数致死量分别为18.9 mg/L和22.9mg/L。这一结果证明了GP不具有治疗的特异性，单独使用易对正常细胞产生副作用，降低其治疗效果。形成纳米粒子之后，HGP对PC-3细胞和COS7细胞的半数致死量分别为21.3 mg/L和45.0 mg/L。这是因为HA能够靶向识别PC-3细胞表面过度表达的CD44受体，此外当HGP进入肿瘤细胞后，较低的pH会破坏其硼酸酯键并释放出药物，因此HGP能够保持对PC-3细胞较高的抑制作用。而HA缺乏对COS7细胞的靶向选择性，同时HGP在COS7细胞中能够保持稳定，GP不会快速泄漏释放，所以HGP对COS7细胞的毒性较小。

图7 GP与HGP对PC-3细胞（a）和COS7（b）细胞48 h的体外细胞毒性（n=6）Fig.7 In vitro cytotoxicity of GP and HGP against PC-3cells and COS7 cells（n=6）after 48 h

3 结语

基于硼酸酯键制备了两亲性HGP缀合物，其在水溶液中能够自组装形成纳米粒子，并且表现出pH响应性，能够在pH 5.0的环境下快速释放药物。HA的肿瘤靶向性提高了HGP的治疗选择性，肿瘤细胞低pH环境促进了GP的释放，因而本研究制备的纳米粒子能够实现GP的靶向传递和控制释放，降低对正常细胞的毒副作用，提高抗前列腺癌效果。

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Preparation and Characteristics Study of the pH-Responsive Hyaluronic Acid-Gossypol Nanoparticles

SHIYu， WANG Lijuan， XU Shanshan， LIU Xiao， XU Feige，ZHANGManyue， ZHU Dongqi， CHEN Jingxiao， CHEN Jinghua*
（School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

A pH-responsive hyaluronic acid-gossypol conjugate was prepared based on boronate ester，which could be used as prostate cancer therapy.The conjugate could self-assemble into nanoparticle which morphology was observed by transm ission electron microscopy.The nanoparticleswere well-dispersed w ith 40 nm diameter.The pH responsible drug release behavior was confirmed by in vitro drug release study.In vitro cytotoxicity study illustrated a favorable selectivity，since the half maximal inhibitory concentration （IC50）of the nanopaticles against prostate cancer cells was lower than that of normal cells.The designed nanoparticle showed great potential for targeted delivery ofgossypoland treatmentofprostate cancer.

pH-responsive，boronateester，gossypol，nanoparticles，cytotoxicity

R 944.9

A

1673—1689（2017）04—0400—05

2015-05-12

江苏省自然科学基金项目（BK2012557）；江苏省普通高校研究生科研创新计划项目（KYLX_1172）；江南大学大学生创新训练计划项目（2015315Y）；安徽大学现代生物制造协同创新中心开放课题（BM2015008）。

*通信作者：陈敬华（1971—），男，湖北黄石人，理学博士，教授，博士研究生导师，主要从事生物制药及活性大分子研究。

E-mail：jhchenwhut@126.com

施瑜，王丽娟，徐珊珊，等.pH响应型透明质酸-棉酚纳米粒子的制备及其性能研究[J].食品与生物技术学报，2017，36（04）：400-404.