孕期LPS刺激对子代6周龄大鼠血管结构的影响

赵钐妤,刘 雅,李晓辉

(1.第三军医大学药学系药物研究所，重庆 400038；2.大理大学基础医学院病理学教研室，云南 大理 671000)

孕期LPS刺激对子代6周龄大鼠血管结构的影响

赵钐妤1,2,刘 雅1,李晓辉1

(1.第三军医大学药学系药物研究所，重庆 400038；2.大理大学基础医学院病理学教研室，云南 大理 671000)

目的 研究孕期炎症刺激剂脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)刺激对子代大鼠6周龄时血管结构的影响。方法 12只Sprague dawley(SD)孕鼠随机分为3组：对照组(control，Con)、LPS刺激组、LPS刺激加二硫代氨基四氢呋喃(pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC)干预组(L+P)，分别在孕8～14 d腹腔注射生理盐水、LPS(0.79 mg·kg-1)或LPS加PDTC(100 mg·kg-1)，LPS于孕d 8、10、12给药；生理盐水及PDTC于d 8～14每天给药。子代出生6周测体质量；透射电镜观察血管超微结构；实时荧光定量PCR检测仔鼠胸主动脉连接蛋白(connexin，Cx)Cx37、Cx40、Cx43、Cx45的mRNA表达水平；Western blot和免疫荧光检测仔鼠胸主动脉Cx37、Cx40、Cx43、Cx45的蛋白表达水平。结果 与Con组相比，LPS组子代大鼠在6周时♂♀体质量均明显增加(P<0.01)；L+P组♂鼠明显低于LPS组(P<0.05)，而♀鼠差异无显著性。LPS组内皮受损，内皮细胞间可见明显缝隙连接(gap junction，GJ)，相对于Con组较长且多见；L+P组内皮损伤程度较LPS组稍有改善。LPS组Cx43 mRNA及蛋白表达均明显低于Con组(P<0.05)，L+P组则明显高于LPS组(P<0.05)；Cx37、Cx40和Cx45各组间mRNA及蛋白表达差异无统计学意义。LPS组Cx43荧光强度及荧光点数明显比Con组降低，而L+P组明显比LPS组高，各组间Cx37、Cx40和Cx45荧光强度和荧光点数并无明显差异。结论 孕期LPS刺激可致子代大鼠在6周龄时出现血管结构损伤，这种损伤可能持续于新生儿期，并与其成年发生高血压密切相关。

孕期炎症刺激；血管结构；缝隙连接；连接蛋白；高血压；NF-κB

本实验室前期研究发现，于大鼠孕期给予炎症刺激剂脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)或酵母多糖刺激，子代大鼠从6周龄开始血压升高，随着鼠龄增加，血压不断升高，至24周龄达高血压标准；子代大鼠体重增加、脂肪重量异常等[3-4]。在小鼠中的研究也表明，孕期炎症刺激可致子代小鼠脂肪发育异常，影响其脂质代谢[5]。同时，出现血管反应性异常，局部肾素血管紧张素改变及肾损伤等[6-7]。针对孕期炎症刺激对于子代大鼠血管结构的影响，本课题组前期研究发现孕期给予LPS刺激后，子代大鼠从新生儿期，即出生1 d至1周，血管即出现损伤[8]。然而，孕期刺激后，子代大鼠6周龄血压开始升高时的血管结构是如何改变，尚未见报道。因此，本研究在前期研究的基础上，观察了孕期LPS刺激后，子代大鼠6周龄时胸主动脉结构的改变，以期对孕期炎症刺激致子代高血压的机制做进一步的研究。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂与仪器 清洁级SD孕鼠购于第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心。总RNA提取试剂盒(离心柱型)(TIANGEN)；逆转录试剂盒及扩增试剂盒(TaKaRa)；脂多糖(Sigma)；二硫代氨基四氢呋喃(PDTC)(Sigma)；氯化钠注射液(太极西南药业股份有限公司)；化学发光试剂(Millipore)；显影液及定影液(柯达)；抗体：Cx37(Abcam， ab101928；Santa Cruz，sc-27716)、 Cx40(Abcam， ab101929；Santa Cruz，sc-20466)、Cx43(Abcam，ab11370)、Cx45(Abcam)、GAPDH(Cell Signing Technology)、β-actin(Santa Cruz)、山羊抗小鼠IgG-HRP(Santa Cruz)、山羊抗兔IgG-HRP(中杉金桥)。荧光定量PCR仪/Relplex(Epqradient)；ND-2000微量核酸定量仪，NANO DRDP 2000(Thermo)；低温离心机，H1650-W(Sigma)；正置显微镜，E-100(Nikon)；垂直电泳仪、转膜仪等(BIO-RAD)。与透射电镜及激光共聚焦相关的试剂及仪器均由第三军医大学中心实验室提供。

1.2 实验动物分组及处理 12只孕鼠随机分为3组：对照组(Con)、LPS刺激组(LPS)、LPS刺激加PDTC干预组(L+P)。Con组在孕d 8～14每天腹腔注射生理盐水0.5 mL；LPS组在孕d 8、10、12腹腔注射LPS(0.79 mg·kg-1)，d 8～14每天注射生理盐水0.5 mL；L+P组在孕d 8、10、12注射LPS，同时d 8～14注射PDTC(100 mg·kg-1)。出生6周龄时称体质量，各组随机处死8只仔鼠，取主动脉弓至胸主动脉分叉处进行后续实验。

1.3 子代大鼠胸主动脉超微结构观察 主动脉弓段在戊二醛中切成小段(0.2～0.3 cm)固定过夜，脱水、包埋、超薄切片、染色后在透射电镜下观察其超微结构。

1.4 胸主动脉Cx37、Cx40、Cx43及Cx45的mRNA含量检测 取胸主动脉段至分叉处组织，进行RNA提取、逆转录、实时荧光定量PCR检测。用β-actin作为内参基因，采用2-ΔΔCt法进行计算。引物序列均由上海生工生物工程公司合成、纯化(Tab 1)。

Tab 1 Primer sequences

1.5 胸主动脉Cx37、Cx40、Cx43及Cx45的蛋白含量检测 胸主动脉提取蛋白，采用Western blot检测Cx37、Cx40、Cx43及Cx45的蛋白表达水平(Cx37、Cx40及Cx43蛋白检测采用GAPDH作为内参蛋白；Cx45检测采用β-actin作为内参蛋白)。凝胶分析系统Quantity One计算条带光密度。

1.6 胸主动脉Cx37、Cx40、Cx43及Cx45的免疫荧光检测 降主动脉段OCT包埋，冰冻切片，固定，封闭、一抗孵育、Cy5二抗孵育、DAPI工作液染核，封片，激光共聚焦显微镜下观察各组Cx37、Cx40、Cx43及Cx45的免疫荧光表达情况。

第三、银子“有灵说”。在白银古道及其左近区域民间还有许多关于银子“有灵说”的故事。老人家多耳熟能详。大体上说，许多上代财主、大贾发家之后本着财不露眼的原则将一些银子或埋于地下，或藏于墙间，或藏于房间地板之下等等。随着年代的久远，或因主人突然去世而遗忘。但年代久远的银子会变成兔子、羊等动物，晚上出来玩耍，如遇有缘之人，去追由白银变成的兔子或羊，则可得到银子。如上洋村就有此传说，相传，彭八公在煽炼银子时，曾在围城底藏有银子两缸，并在路旁岩壁上刻着：“银藏围城底，弗是在山冈；孰会猜得中，拾银两大缸。”古往今来，这两缸银子藏在何方？无人猜得中。

2 结果

2.1 子鼠出生情况 见参考文献[8]。

2.2 子代大鼠6周时体质量情况 LPS组子代大鼠在6周时♂♀体质量均明显高于对照组[分别为(107.062±14.470)g比(57.262±9.817)g，(100.15±13.104)g比(68.325±19.056)g,P<0.01，n=8]，L+P组♂鼠[(89.557±15.756)g]明显低于LPS组(P<0.05)，而♀鼠[(103.45±16.912)g]无差异(n=8)。

2.3 子代大鼠6周时胸主动脉超微结构 如Fig 1所示，子代大鼠在出生第6周时，Con组内皮层未见损伤，内皮细胞(endothelial cell，EC)形态完整，内弹力膜完整，平滑肌层细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)排列整齐，胞核形态规则，平滑肌层弹性纤维及胶原纤维连续完整，各细胞器正常，EC间可见膜通道结构的GJ(Fig 1A、1B)；LPS组内皮层受损，EC见大量破裂，内弹力膜断裂，VSMC排列相对紊乱，胞核形态不规则，明显向内皮层生长，EC间明显可见GJ，相对于Con组较长且多见(Fig 1C、1D)；L+P组内皮损伤程度较LPS组稍有改善，VSMC排列紊乱，EC间可见GJ(Fig 1E、1F)。

Fig 1 Representative transmission electron micrographs of aortas in 6-week offspring

A,B:Con group;C,D:LPS group;E,F:L+P group.EC:endothelial cell, SMC: smooth muscle cell, IE: internal elastic lamina, GJ: gap junction, L: lumen

2.4 子代大鼠6周时Cx37、Cx40、Cx43、Cx45的mRNA表达 如Fig 2所示，子代大鼠6周时，♀♂间胸主动脉Cx mRNA的表达无差异。LPS组Cx43的mRNA表达明显比Con组降低(P<0.05)；L+P组Cx43的mRNA表达明显比LPS组增加(P<0.05)。各组间Cx37、Cx40及Cx45的mRNA表达差异没有统计学意义。

Fig 2 mRNA expression of connexin

*P<0.05vsCon;#P<0.05vsLPS

2.5 子代大鼠6周时Cx37、Cx40、Cx43、Cx45的蛋白表达 如Fig 3～6所示，LPS组胸主动脉Cx43的蛋白表达比Con组明显降低(P<0.05)；L+P组Cx43的蛋白表达比LPS组明显升高(P<0.05)。各组间Cx37、Cx40、Cx45的蛋白表达差异没有统计学意义。

Fig 3 Protein expression of Cx37 in 6-week

2.6 子代大鼠6周时Cx37、Cx40、Cx43、Cx45免疫荧光表达 如Fig 7所示，Cx37和Cx40主要在血管内皮表达，Cx43和Cx45主要在平滑肌层中大量表达。♀鼠与♂鼠的胸主动脉Cx37、Cx40、Cx43和Cx45免疫荧光结果并无明显差别。LPS组的Cx43荧光强度及荧光点数明显比Con组降低；L+P组Cx43的荧光强度及荧光点数明显比LPS组增高。各组间Cx37、Cx40和Cx45的荧光强度和荧光数量并无明显差异。

Fig 4 Protein expression of Cx40 in 6-week

Fig 5 Protein expression of Cx43

*P<0.05vsCon;#P<0.05vsLPS

3 讨论

有研究表明[9]，动脉壁结构变化所致的大动脉顺应性降低，是心脑血管疾病发生发展的独立危险因素，高血压大鼠主动脉中出现血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ ，AngⅡ)受体AT1、AT2表达改变等[10]，这些均说明，大动脉的病变对于高血压的发生发展具有重要的意义。本研究结果表明，孕期LPS刺激子代大鼠在6周龄时胸主动脉出现内皮损伤，内弹力膜断裂，VSMC明显向内膜生长等病理改变，这些病变可能是继新生儿期血管病变后的持续病变，其所致的血管壁增厚、血管紧张度改变等，可能是其在6周龄即出现血压升高的关键，也是高血压维持和发展的结构基础。至子鼠12周龄，内皮损伤越发严重，VSMC增殖、迁移更为明显，血管反应性异常[11]。孕期LPS刺激后，从大鼠出生后的持续的血管病变，可能是子代大鼠高血压发生的重要原因。

Fig 6 Protein expression of Cx45 in

Fig 7 Immunolabeling of connexin in 6-week offspring aorta(scale:25 μm)

本实验室前期研究表明，孕期LPS刺激致子代发生高血压与血管及肾脏局部肾素血管紧张素系统(renin angiotensin system，RAS)异常激活相关，孕期LPS刺激同时给予核转录因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)特异性抑制剂PDTC能逆转子代血压的升高，改善血管的功能[6-7,12-13]；最新研究亦表明孕期炎症刺激所致的NF-κB的调节紊乱，可作用于RAS系统的异常激活，也是子代高血压发病的机制之一[14]。连接血管细胞之间的连接通道排列而成一种特殊膜结构，称之为缝隙连接(GJ)，其由细胞膜上的连接子相互衔接而成，每个连接子由6个Cx组成。组成同一个连接子的Cx可同可不同，因而使连接子所形成的连接通道具有不同的通透性和选择性。大动脉中常见的连接蛋白为Cx37、Cx40、Cx43及Cx45。小鼠的基因敲除实验证实了GJ与血压调节存在着一定联系[15]，Cx的表达与高血压的关系，可能是其参与了肾素及对内皮一氧化氮合酶(endothelium NO synthase，eNOS)的调节[16-17]，不同类型的高血压模型中，主动脉Cx受到不同的调节，表达变化不一致，这说明不同的Cx可能具有共同或独特的功能[18]。前期研究发现[8]，孕期炎症刺激后，子代大鼠在新生儿期就出现Cx的异常变化，但在子代大鼠6周龄，即血压开始升高时，Cx的变化如何，尚未见报道。本研究结果提示，孕期LPS刺激后，子代大鼠在6周龄时其胸主动脉内皮细胞间的GJ较对照组多且长，平滑肌细胞之间及异型细胞之间的GJ少见；同时，Cx43的mRNA及蛋白表达明显降低，而Cx37、Cx40及Cx45的mRNA及蛋白表达无明显改变；孕期LPS刺激同时给予PDTC干预可明显增加子代大鼠6周龄时Cx43的mRNA及蛋白表达量。Cx43对于压力改变较为敏感，在血管壁中含量最为丰富，Cx43通道所调节的细胞间信号交流可参与血管壁弹性的调节，从而影响高血压的发生发展，在不同的高血压模型中，Cx43的表达有差异[19]；Cx基因敲除小鼠外周血中Ang Ⅱ含量明显增加，Cx43表达升高可有效降低自发性高血压大鼠的血压[20]。我们的研究发现，孕期LPS刺激后，从新生儿期开始，子代大鼠随着鼠龄的增加，血管损伤进一步加重，血压升高，Cx的mRNA及蛋白表达呈现出不同的变化格局[8,11](部分数据未列出)。因此，有理由推测Cx表达改变是孕期LPS刺激后，其子代大鼠维持血管稳态的适应性反应，主动脉缝隙连接的异常及Cx43表达的异常与其血管的损伤密切相关。Alonso等[21]研究发现，Cx43在高血压中表达异常，可能与Ang Ⅱ及NF-κB的异常调节有关，NF-κB能直接并特异地与编码Cx43的Gja1基因的启动子位点结合，从而直接调节Cx43的表达。本实验用NF-κB特异性抑制剂PDTC干预后，可逆转Cx43的异常表达，因此我们推测孕期炎症刺激致子代大鼠6周龄时Cx43的异常表达可能受血管组织中NF-κB的调节。

综上所述，孕期炎症刺激致子代大鼠6周龄时血管结构的损伤，是继新生儿期就开始的损伤的持续性变化；是子代大鼠6周龄即出现血压异常的结构基础，也可能是其成年大鼠高血压发生的关键因素。

(致谢：本实验老鼠模型建立、RT-PCR、WB等相关实验在第三军医大学药学系药物研究所完成；免疫荧光实验及透射电镜实验在第三军医大学中心实验室完成。感谢中心实验室老师对激光共聚焦及透射电镜的技术指导。)

[1] Barker D J .In utero programming of cardiovascular disease[J].Theriogenology, 2000,53(2):555-74.

[2] Eriksson J G, Forsen T, Tuomilehto J, et al. Early growth and coronary heart disease in later life: longitudinal study[J].BMJ,2001,322(7292):949-53.

[3] Wei Y L, Li X H, Zhou J Z. Prenatal exposure to lipopolysaccharide results in increases in blood pressure and body weight in rats[J].ActaPharmacolSin,2007,28(5):651-6.

[4] Liao W, Wei Y L, Yu C, et al. Prenatal exposure to zymosan results in hypertension in adult offspring rats[J].ClinExpPharmacolPhysiol,2008,35(12):1413-8.

[5] 秦书刚,陈 新,贾 乙,等.孕期炎症刺激对子代小鼠脂质代谢及FAT/CD36表达的影响[J].中国药理学通报,2016,32(8):1080-5.

[5] Qin S G, Chen X, Jia Y, et al. Prenatal exposure to lipopolysaccharide results in lipid metabolism and FAT/CD36 expression in mice offspring[J].ChinPharmacolBull, 2016,32(8):1080-5.

[6] 贺小艳,邓有才,李淑慧,等.孕期脂多糖刺激对子代大鼠血管肾素血管紧张素系统的影响[J].中华心血管病杂志,2011,39(9):853-6.

[6] He X Y, Deng Y C, Li S H, et al. Prenatal exposure to lipopolysaccharide results in vascular renin-angiotensim system dysfunction in offspring rats[J].ChinJCardiol, 2011,39(9):853-6.

[7] Hao X Q, Zhang H G, Li S H, et al. Prenatal exposure to inflammation induced by zymosan results in activation of intrarenal reninangiotensin system in adult offspring rats[J].Inflammation,2010,33(6):408-14.

[8] 赵钐妤,刘 雅,李晓辉.孕期炎症刺激对子代大鼠新生儿期血管结构的影响[J].中华心血管病杂志,2014,42(6):498-503.

[8] Zhao S Y, Liu Y, Li X H. Effect of maternal lipopolysaccharide exposure during pregnancy on vascular structure in neonatal offspring rats[J].ChinJCardiol, 2014,42(6):498-503.

[9] Chobanian A V, Bakris G L, Black H R, et al. The seventh report of the Joint National Committee on prevention, detection, evaluation, and treatment of high blood pressure:the JNC 7 report[J].JAMA,2003,289(19):2560-72.

[10]Romero-Nava R, Rodriquez J E, Reséndiz-Albor A A, et al. Changes in protein and gene expression of angiotensin Ⅱ receptors(AT1 and AT2) in aorta of diabetic and hypertensive rats[J].ClinExpHypertens,2016,38(1):56-62.

[11]Zhao S Y, Zhang H G, Cao D Y, et al. Lipopolysaccharide exposure during pregnancy leads to aortic dysfunction in offspring rats[J].PLoSOne,2014,9(7):e102273.

[12]Hao X Q, Zhang H G, Yuan Z B, et al. Prenatal exposure to lipopolysaccharide alters the intrarenal renin-angiotensin system and renal damage in offspring rats[J].HypertensRes, 2010, 33(1):76-82.

[13]苗 莹,唐 渊,李晓辉.孕期暴露于脂多糖对子代中年大鼠血管重构和血压的影响及其机制[J].第三军医大学学报,2009,31(7):569-71.

[13]Miao Y, Tang Y, Li X H. Alteration of vascular remolding and blood pressure in rat offsprings following maternal exposure to LPS during pregnancy[J].ActaAcadMedMilTert,2009,31(7):569-71.

[14]Deng Y C, Deng Y F, He X Y, et al. Prenatal inflammation-induced NF-κB dyshomeostasis contributes to renin-angiotensin system over-activity resulting in prenatally programmed hypertension in offspring[J].SciRep,2016,6:21692.

[15]Simon A M, McWhorter A R. Decreased intercellular dye-transfer and downregulation of non-ablated connexins in aortic endothelium deficient in connexin37 or connexin40[J].JCellSci, 2003,116(Pt 11):2223-36.

[16]Le Gal L,Alonso F,Wagner C, et al. Restoration of connexin 40(Cx40) in renin-producing cells reduces the hypertension of Cx40 null mice[J].Hypertension,2014,63(6):1198-204.

[17]Le Gal L, Alonso F, Mazzolai L, et al. Interplay between connexin40 and nitric oxide signaling during hypertension[J].Hypertension,2015,65(4):910-5.

[18]Plum A, Hallas G, Magin T, et al. Unique and shared functions of different connexins in mice[J].CurrBiol,2000,10(18):1083-91.

[19]Haefliger J A, Meda P. Chronic hypertension alters the expression of Cx43 in cardiovascular muscle cells[J].BrazJMedBiolRes,2000,33(4):431-8.

[20]Dlugosova K, Okruhlicova L, Mitasikova M, et al. Modulation of connexin-43 by omega-3 fatty acids in the aorta of old spontaneously hypertensive rats[J].JPhysiolPharmacol, 2009,60(3):63-9.

[21]Alonso F, Krattinger N, Mazzolai L, et al. An angiotensin Ⅱ- and NF-kappa B-dependent mechanism increases connexin 43 in murine arteries targeted by renin-dependent hypertension[J].CardiovascRes,2010,87(1):166-76.

Effect of maternal lipopolysaccharides exposure during pregnancy on vascular structure in 6-week offspring rats

ZHAO Shan-yu1,2, LIU Ya1, LI Xiao-hui1
(1.InstituteofMateriaMedicaandDeptofPharmaceutics,CollegeofPharmacy,theThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China;2.DeptofPathology,BasicMedicalScienceSchoolofDaliUniversity,DaliYunnan671000,China)

Aim To explore the role of prenatal exposure to lipopolysaccharides(LPS) on aortic morphology in the 6-week offspring rats. Methods Twelve pregnant rats were randomly divided into three groups: control group, LPS group, L+P(pyrrolidinedithiocarbamate,PDTC)group. The rats were intraperitoneally administered vehicle, LPS(0.79 mg·kg-1),or LPS plus PDTC(100 mg·kg-1).LPS was given on the 8th,10th and 12th day, where as vehicle and PDTC were given daily from the 8th to the 14th day during gestation. Offspring body weight was measured at 6-week, and histopathological alteration of the thoracic aorta was observed by transmission electron microscopy, the thoracic aorta mRNA and protein expression of connexin(Cx) molecules including Cx37, Cx40,Cx43 and Cx45 in offspring rats were detected by real time PCR ,Western blot and confocal laser-scanning microscope.Results Body weight at 6-week offspring rats was significantly higher in LPS group than in control group whatever male or female(P<0.01);and that in L+P group was significantly lower than in LPS group in male rats(P<0.05),but not in female rats. The LPS group thoracic aortas exhibited lesions, including impaired endothelial cells, and the vascular smooth muscle cells were arranged disorder and migration and proliferation; the number of gap junction was increased and longer than control group; the pathological changes were improved to some extent in L+P group. Cx43 mRNA and protein expression in LPS group was obviously lower than in control group(P<0.05), which could be partly reversed in L+P group(P<0.05). There was no significant difference in Cx37,Cx40 or Cx45 mRNA or protein expression among each group.The results of protein expression with confocal laser-scanning microscope was the same as those of Western blot.Conclusion Maternal LPS exposure during pregnancy leads to vascular changes in 6-week offspring rats, which might last until neonatal stage, and is closely correlated to hypertension in adult offsprings.

pregnant inflammation exposure; vascular structure; gap junction; connexin; hypertension; NF-κB

2016-12-10,

2017-01-15

国家自然科学基金资助项目 (No 81373420，81573440，81273507，81473210)

赵钐妤(1988-)，女，硕士，助教，研究方向：抗炎免疫与心血管药理学，E-mail：zhaoshanyu2011@163.com； 李晓辉(1962-)，男，博士，教授，博士生导师，研究方向：抗炎免疫与心血管药理学，通讯作者，E-mail：lpsh008@aliyun.com

时间：2017-4-24 11:20

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170424.1120.030.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.05.015

A

1001-1978(2017)05-0662-06

R-332；R322.12；R343.9；R364.5；R544.1；R977.6