利用CRISPR-Cas9系统敲除小鼠黑色素瘤细胞系MATP基因的初步研究

殷慧慧，李 丹，李 钰，孙 菲，董施施，孔江峰，王洪宝，曾 林，法云智，孙兆增

(军事医学科学院实验动物中心，北京 100071)

研究报告

利用CRISPR-Cas9系统敲除小鼠黑色素瘤细胞系MATP基因的初步研究

殷慧慧，李 丹，李 钰，孙 菲，董施施，孔江峰，王洪宝，曾 林，法云智，孙兆增

(军事医学科学院实验动物中心，北京 100071)

目的 利用CRISPR/Cas9系统，敲除小鼠黑色素瘤细胞系的MATP基因，为MATP基因的功能研究奠定基础。方法 利用http://crispr.mit.edu/网站，设计针对MATP的特异性引物，并将引物链接到pCAS9/gRNA1载体。将阳性载体转染小鼠黑色素瘤细胞系B16F10，利用无限稀释的方法获得转染后的单克隆细胞株。提取不同细胞株的基因组，通过测序的方法进一步筛选出发生MATP基因切割的细胞株，并利用Western-blot的方法验证MATP的表达情况。结果 成功获得了3株MATP基因敲除的细胞株，Western-blot结果表明，该细胞株不表达MATP蛋白。结论 利用pCAS9/gRNA1载体，可以实现B16F10细胞系MATP基因的敲除。

CRISPR-Cas9; 黑色素瘤细胞;MATP; 研究

眼皮肤性白化病是由于不同黑色素合成或转运相关基因突变而导致的具有相同或相似临床症状的一类遗传性疾病的总称[1]，根据涉及基因的不同，OCA(oculocutaneous albinism)可以分为4个常见类型，即OCA1-OCA4[2]。OCA4是一种发现较晚的眼皮肤白化病，它是由编码膜相关转运蛋白MATP(membrane-associated transporter protein，MATP)基因突变而导致的白化类型[3]。MATP基因为膜相关转运蛋白，该基因定位于5号染色体，由7个外显子和6个内含子组成，共有530个氨基酸残基[4]。通过分析膜相关转运蛋白的结构，推测其可能存在转运功能。

CRISPR/Cas9是一种来源于细菌的由RNA 指导 Cas9蛋白对基因进行编辑和修饰的新技术[5]。这种核酸酶活性仅仅需要一种非编码RNA (sgRNA) 介导下即可实现定向基因打靶， CRISPR/Cas9系统是相对于 ZFNs 和TALENs 更为简便、快速的基因组编辑技术[6]，在细菌、哺乳动物细胞以及斑马鱼、小鼠、大鼠等都表现出很强的基因组编辑活性[7, 8]。因此本研究拟利用CRISPR/Cas9技术，实现对小鼠黑色素瘤细胞系B16F10细胞系MATP基因的敲除。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂：pCAS9/gRNA1质粒，由北京英茂盛业生物科技有限公司提供。常用的分子生物学试剂和细胞培养液等分别购自TAKARA、NEB和GE Healthcare等公司。MATP抗体(ab57270)，购自Abcam公司；Beta actin抗体(TA-09)，购自中山金桥公司。

1.1.2 菌种及细胞株：实验中所用的大肠杆菌感受态 DH5α和小鼠黑色素瘤细胞系B16F10，由本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 MATP特异性引物的设计：根据MATP第1个外显子的序列，利用http://crispr.mit.edu/网站设计两对特异性引物(Score值在80以上)。根据pCAS9/gRNA1载体的要求，设计两对引物，MATP1上下游引物序列分别为：5-acaccgCCGAGAGTTT TGCTATGCGGgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtc cgtt-3(其中大写字母为MATP特异性序列，其余为载体序列，下同。)和5-aacggactagccttattttaacttgct atttctagctctaaaacCCGCATAGCAAAACT CTCGGcggtgt-3；MATP2上下游引物序列分别为：5-acaccgTTAGCC GAGGATTGCCCCTTgttttagagctagaaatagcaagttaaaataagg ctagtccgtt-3和5-aacggactagccttattttaacttgctatttctagctcta aaacAAGGGGCAATCCTCGGCTAAcggtgt-3。

1.2.2 pCAS9/gRNA1-MATP载体的构建：将MATP1上和MATP1下以及MATP2上和MATP2下两对引物分别进行退火，合成双链寡核苷酸。利用EcoRV将2μg pCAS9/gRNA1质粒(图1)线性化，回收线性化的质粒并定量。用水将退火后的双链寡核苷酸稀释100倍，利用T4连接酶将上述2种寡核苷酸连接到线性化的pCAS9/gRNA1质粒。

1.2.3 pCAS9/gRNA1-MATP载体转化和阳性克隆的筛选：连接后产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取多个菌落至氨苄抗性的培养基中培养后进行鉴定。鉴定所用的引物，gRNA-F：GACTATC ATATGCTTACCGTAACT，gRNA-R：GACTATCATAT GCTTACCGTAACT。直接利用菌液PCR的方法进行鉴定，阳性质粒分别命名为：pCAS9/gRNA1-MATP1和pCAS9/gRNA1-MATP2。

1.2.4 pCAS9 /gRNA1-MATP1和pCAS9/gRNA1-MATP2两种质粒的转染：将B16F10细胞传代至6孔培养板，在细胞密度达到80% 时，利用lipofectamine 2000转染试剂进行细胞转染，两种质粒的用量都是1 μg。换新鲜培养基培养72 h，利用胰酶进行消化。收获细胞后，按照107倍稀释细胞，并接种到96孔板。由于B16F10细胞能够产生大量的黑色素，在显微镜下能够明显观察到黑色素的聚集，并且在细胞浓度较高时，培养液染色很快会发生变化。因此利用B16F10细胞的这种特性，可以筛选到与野生细胞株不同的单克隆细胞株。筛选到单克隆细胞后，提取细胞的基因组，利用PCR的方法扩增MATP基因第1个外显子的序列，通过测序的方法进一步确定MATP基因的敲除情况。

1.2.4MATP基因敲除细胞株中MATP蛋白的表达情况检测：利用Western-blot实验检测MATP蛋白的表达情况：收取的细胞沉淀中加入RIPA裂解液裂解，并进行SDS-PAGE电泳。恒流250 mA转膜后，利用MATP抗体检测MATP蛋白的表达情况，β-actin作为实验的阳性对照。

2 实验结果

2.1 pCAS9 /gRNA1-MATP1和pCAS9/gRNA1-MATP2质粒的筛选结果

挑取24个转化pCAS9 /gRNA1-MATP1质粒的单菌落，培养后利用菌液PCR筛选阳性克隆，共筛选到5个阳性克隆，见图2。

挑取23个转化pCAS9 /gRNA1-MATP2,质粒的单菌落，共筛选到8个阳性克隆，见图3。从阳性菌株中提取质粒，送测序公司进行序列测定。

2.2 B16F10细胞MATP基因敲除情况分析结果

通过黑色素的产生和培养液的变化情况，共筛选到8株疑似MATP基因敲除的细胞克隆。提取这8株细胞的基因组，利用PCR的方法获得MATP基因第1个外显子的序列，分别进行了测序。其中3株细胞株发生了MATP基因的移码突变，其中2个细胞株为编码框35位的C碱基缺失，1个细胞株为36位的G碱基缺失。

2.3MATP基因敲除细胞株MATP蛋白的表达情况检测结果

利用Western-blot检测结果表明，发生了MATP基因移码突变的3株细胞株，检测不到MATP蛋白的表达，结果见图4，说明成功实现了B16F10细胞MATP基因的敲除。

图1 pCAS9/gRNA1质粒示意图Fig.1 Diagram of the pCAS9/gRNA1 plasmid

M：DNA分子量标准；9,12,18,19,22为阳性；其余为阴性图2 pCAS9 /gRNA1-MATP1质粒阳性菌株的筛选Fig.2 Screening of pCAS9/gRNA1-MATP1 plasmid-positive strains. M: DNA molecular weight markers; 9, 12, 18, 19, and 22 are positive. The others are negative.

M：DNA分子量标准；4, 6, 9, 11, 16, 17, 19, 20为阳性；其余为阴性图3 pCAS9 /gRNA1-MATP2质粒阳性菌株的筛选Fig.3 Screening of pCAS9/gRNA1-MATP2 plasmid-positive strains. M: DNA molecular weight markers; 4, 6, 9, 11, 16, 17, 19, and 20 are positive; The others are negative.

1,2,3为MATP基因移码突变的3株细胞株，4,5,6为野生细胞株图4 MATP蛋白表达的Western-blot检测结果Fig.4 Western-blot detection of the MATP protein expression. 1, 2, 3 are the cell lines with the frameshift mutation of MATP gene; 4, 5, 6 are the wild-type cell lines.

3 讨论

由于其具有特异性高，分子构建简单，流程短的特点,近年来CRISPR/Cas9 技术获得了快速发展。使用 CRISPR/Cas9 技术进行基因敲除需要两个关键因素，首先是有效的 sgRNA 引导序列，再就是Cas9蛋白的存在[9]。因此在利用CRISPR/Cas9 技术进行基因敲除，需要两个质粒，并且需要将sgRNA序列和Cas9序列在体外转录成RNA。而pCAS9/gRNA1质粒，在同一个质粒中表达Cas9蛋白和sgRNA，实现单独转染一个质粒即可产生基因敲除效果，操作更为简单，并且在哺乳动物细胞中具有较高的敲除效率。本实验利用该pCAS9 /gRNA1质粒，成功实现了B16F10细胞MATP基因的敲除，进一步证实单一质粒敲除的有效性。

B16F10细胞是小鼠黑色素瘤高转移细胞,在体外培养时可以产生大量的黑色素[10]。细胞产生的大量黑色素可以在显微镜下清楚的观察到，并且黑色素的产生可以使培养基很快变色，这种特点在在研究黑色素形成相关基因尤其有用[11]。 B16F10细胞的MATP基因敲除后，黑色素的形成能力受到较大的影响，因此通过细胞黑色素形成的差异，能够比较容易的筛选到基因敲除的细胞株。本实验利用这个特点筛选到8个疑似MATP基因敲除细胞株，通过基因克隆测序的方法证实确有3株细胞株发生了MATP基因的敲除。该实验为黑色素相关基因的功能研究提供了一些有用的参考。

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A preliminary study on theMATPgene knockout in a mouse melanoma cell line using CRISPR-Cas9 system

YIN Hui-hui, LI Dan, Li Yu, SUN Fei, DONG Shi-shi, KONG Jiang-feng,WANG Hong-bao, ZENG Lin, FA Yun-zhi, SUN Zhao-zeng

(Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China)

Objective To knockout theMATPgene of mouse melanoma cell line B16F10 using CRISPR/Cas9 system, and to lay foundation for the functional study ofMATPgene.Methods Specific primers ofMATPwere designed according to the report in http://crispr.mit.edu/ website. The primers were linked to pCAS9/gRNA1 vector. Then the positive vector was transfected into mouse melanoma B16F10 cells, and monoclonal cell lines were obtained by the infinite dilution method. After the genomes of different monoclonal cell lines were extracted and sequenced, the cell lines withMATPgene cleavage were screened, and the expression ofMATPin these cell lines was verified by Western-blot analysis. Results ThreeMATPgene knockout cell lines were successfully obtained. The western-blot results showed that the cell lines did not express MATP protein. Conclusions The knockout ofMATPgene in B16F10 cell line can be successfully achieved using the pCAS9/gRNA1 vector.

CRISPR-Cas9; Melanoma cells;MATP; Mouse melanoma cell lines

国家自然科学基金31272387，全军实验动物专项课题SYDW〔2014〕006。

殷慧慧(1990-)女，硕士研究生，研究方向为实验动物疾病模型。E-mail: yinhuhui2014@163.com。

孙兆增(1977-)男，研究员，硕士生导师，研究方向：实验动物疾病模型。E-mail: laxszz@aliyun.com。

R-33

A

1671-7856(2017) 04-0052-04

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.04.009

2016-12-08