Shkbp1缺失对小鼠 T淋巴细胞系亚群的影响

刘 擎，张潇涵，仰明明，周泽启，王丽京，李江超

(广东药科大学 基础学院血管生物学研究所，广州 510006)

研究报告

Shkbp1缺失对小鼠 T淋巴细胞系亚群的影响

刘 擎，张潇涵，仰明明，周泽启，王丽京，李江超

(广东药科大学 基础学院血管生物学研究所，广州 510006)

目的 探讨Shkbp1缺失小鼠(Shkbp-1-/-)的血液、骨髓、脾脏中血液细胞分类和T细胞亚群的变化。方法 采用Shkbp-1-/-转基因小鼠，经PCR 鉴定基因型；利用全自动血液检测仪测定血液细胞分类；采用流式细胞仪检测Shkbp-1-/-和对照组小鼠血液、骨髓、和脾脏中T 淋巴细胞亚群。结果 血常规结果：中性粒细胞和嗜酸性粒细胞有增高趋势，且有显著差异。淋巴细胞未见显著差异。流式结果显示：对照组血液中CD4+CD8+双阳性细胞降低，骨髓中CD3+、CD4+升高。 但脾脏组织中，其CD3+、CD4+、CD8+、CD4+CD8+双阳性细胞均呈下降趋势。结论 Shkbp1参与血液细胞的成熟分化，影响了免疫细胞数量，本研究为探索Shkbp1如何参与血液细胞的分化奠定了研究基础。

Shkbp-1； T细胞亚群；CD3+；CD4+；CD8+；基因工程小鼠

Shkbp1基因于2008年通过酵母双杂交的方法被筛选出来[1]，研究表明Shkbp1蛋白存在两个富含脯氨酸(PXXXPR)的结构域第618～623位氨基酸残基(PSPSPR)和第679-684位氨基酸残基(PTRApR)参与CIN85的SH3保守结构域结合[2，3]。Shkbp1可以竞争抑制CIN85和c-Cbl的结合,从而阻断表皮生长因子受体(EGFR)的内吞和降解。Cbl是一种泛素化激酶，有c-Cbl，Cbl-b和Cbl-3三个成员组成。c-Cbl它能够与酪氨酸激酶和受体酪氨酸激酶结合并被磷酸化，磷酸化后的c-Cbl泛素化激酶活性被激活，使与其结合的酪氨酸激酶和受体酪氨酸激酶多聚泛素化降解[4]。

一般情况下，受体活化并传递信号后就会从细胞表面脱落，以避免信号持续活化对有机体产生伤害。当受体酪氨酸激酶活化后的负调控被阻断或者扰乱后，细胞功能异常，人体就会产生恶性肿瘤等疾病[5]。EGF(表皮生长因子)和EGFR结合，二聚化后自身磷酸化的EFGR与c-cbl(泛素化激酶)通过SH2保守结构域结合并使之磷酸化，激活泛素酶活性使EGFR一部分降解[6-8]。其次，Shkbp1被报道与遗传疾病相关，还有报道其与卵巢癌[9]和白血病[10]相关。

Shkbp1参与血细胞起源、增殖、分化和发育成熟的过程。血细胞在造血器官或组织中产生，发育成熟或接近成熟时才释放到血液中，但是该基因的缺失是否能引起小鼠血液细胞分化和免疫细胞的改变，并未见报道。本研究针对Shkbp1基因缺失小鼠，检测其免疫功能的变化，为深入了解Shkbp1提供了理论基础，为了解Shkbp1对免疫的影响提供了动物水平的模型。本文针对免疫功能检测血常规及流式等一系列实验，旨在探讨该基因缺失条件下的小鼠免疫功能的变化。

1 材料和方法

1.1 实验动物及实验环境

Shkbp1敲除小鼠，简称Shkbp-/-小鼠，以C57BL/6背景，是耿建国教授(密歇根大学)馈赠[11]，由本实验室何晓东老师饲养保种，并且开展了一些早期实验，其结果已经发表[12]。于广东省医学实验动物中心(生产许可证号SCXK(粤)2008-0002)购买C57BL/6小鼠。以上实验用鼠均自由饲养在SPF环境条件，使用许可证号改为【SYXK(粤)2012-0125】。室内温度维持在(24±2)℃之间，湿度保持在40%～60%，噪声小于60 db。

小鼠饲养和鉴定:所有小鼠均于SPF 级环境下饲养，将Shkbp-1+/-雄鼠和Shkbp-1+/-雌鼠杂交，得到的子代有三种情况Shkbp-1+/-、Shkbp-1+/+、Shkbp-1-/-，经鉴定后得到实验鼠Shkbp-/-小鼠和对照鼠Shkbp-1+/+。Shkbp-1 小鼠鉴定引物序列为：P1：5-′CTAAATCACTCCAAAGGATCC-3′；P2：5-′TACCGGTGGATGTGGAATGT-3′；P3：5-′CTAAATCA CTCCAAAGGATCCC-3′；P4：5-′ATTCATGCATTCT CCTTTGGCA-3′。PCR 反应条件为：95℃ 5 min预变性，94℃ 30 s变性，58℃ 30 s退火40 个循环；72℃ 45 s延伸，72℃ 2 min充分延伸，4℃冷却扩增产物。P1 和P2是鉴定突变型条带，扩增条带为307 bp，P3和P4 是鉴定野生型条带，扩增条带为483 bp。在配置好的1.2%琼脂糖凝胶中，利用TAE 电泳缓冲液进行电泳设定条件：165 V，30 min。再将凝胶放置在凝胶成像系统里，电脑成像系统里观察PCR的电泳结果[13]。

1.2 仪器与试剂

PCR 引物购自Life上海分公司，PCR Mix购自美国Thermo Fisher公司；EDTA·K2抗凝管采集血样；利用全自动五分类血液分析仪进行检测分析，其型号XT-2000i，Sysmex，日本；检测时，设置小鼠血样程序进行检测。流式细胞仪型号为：BD FACSCantoTMII，流式细胞术检测抗体：CD3-FITC(11-0032)，CD4-PE(12-0041)，CD8e-PerCP-Cyanine 5.5(45-0081)以上抗体均购自eBioscience 公司。

1.3 血常规检测

取8 周龄的Shkbp-1-/-，C57 小鼠各6 只，乙醚麻醉约1 min，眼眶取血200 μL到1 mL 的EDTA·K2抗凝管中，上机前4℃放置。

1.4 血液CD3、CD4、CD8 细胞检测

取8 周龄的Shkbp-1-/-，C57 小鼠各6 只，眼眶取血到1 mL的EDTA·K2抗凝管中，抽取50 μL，加入CD3、CD4、CD8 抗体避光孵育30 min，用红细胞裂解液裂解15 min，1500 r/min，离心5 min；弃上清液，用0.5% BSA 1 mL 细胞重悬，1 500 r/min，离心5 min，弃上清液；重复1次，取200 μL 混匀，上机检测[14]。

1.5 脾脏CD3、CD4、CD8 细胞检测

以上小鼠摘除脾脏，用0.5% BSA 在0.22 mm 尼龙筛网研磨过滤，取筛网下的液体50 μL，加入CD3、CD4、CD8 抗体避光孵育30 min，用红细胞裂解液裂解10 min，1 500 r/min，离心5 min；弃上清液，用0.5% BSA 1 mL 细胞重悬，1 500 r/min，离心5 min，弃上清；重复1次，取200 μL 混匀，上机检测。

1.6 骨髓CD3、CD4、CD8 细胞检测

将以上小鼠后腿取下，抽提骨髓，同上述分离单细胞，进行流式实验检测。

1.7 统计学方法

实验涉及的数据统计方法：采用M依SD 或中位数表示，利用Gradprim 5.0 软件，采用t检验，假设条件P<0.05 具有统计意义。

2 结果

2.1 Shkbp-1-/-小鼠基因型鉴定

Shkbp1敲除小鼠构建是敲除了Shkbp1基因的1-6个六个外显子而获得的(图1A)。将Shkbp-1+/-雄鼠和Shkbp-1+/-雌鼠杂交，得到的子代有三种情况Shkbp-1+ /-、Shkbp-1+ / +、Shkbp-1-/-，经鉴定后得到实验鼠Shkbp-1-/-小鼠和对照鼠Shkbp-1+/+。其中野生条带在483 bp处，突变条带在307 bp处(图1B)。

2.2 Shkbp-1-/-小鼠血常规检测变化

通过全自动五分类血液分析仪分析血液，设置小鼠血液分类检测程序。检测正常生理条件8周龄的Shkbp-1-/-小鼠与同周龄的C57对比，白细胞总数无明显差异(图2A)。在白细胞分类中，Shkbp-1-/-小鼠与C57相比，淋巴细胞绝对计数有降低趋势，但无显著差异(图2B)；单核细胞绝对计数，两组之间无差异(图2C)。但是，Shkbp-1-/-小鼠与C57相比，中性粒细胞和嗜酸性粒细胞有增高趋势(图2D-图2E)，并且有显著差异(P<0.05)。

2.3 Shkbp-1-/-小鼠外周血中CD4+CD8+双阳性细胞数目降低

T细胞是重要的免疫细胞，CD3+抗体标记的是T淋巴细胞，它是胸腺依赖淋巴细胞，其具有多种重要的免疫功能。不同的免疫功能与其细胞膜上的分化抗原(CD)的种类相关联，其中CD4和CD8是关键的分化抗原。为探究它是否发生变化，我们利用流式检测CD3+，CD4+，CD8+细胞亚群的变化，结果发现，将C57 小鼠和Shkbp-1-/-小鼠的外周血进行红细胞裂解，而后标记CD3、CD4、CD8 抗体，用流式细胞技术进行检测[15，16]。将CD3 阳性细胞进行设区域设门(图3A和3B)。检测结果显示实验组小鼠CD4+CD8+双阳性细胞绝对计数和百分比都有下降趋势，与正常小鼠对比(图3E～图3F)，差异明显(P<0.05)[17，18]。CD4+、CD8+细胞绝对计数及百分比无统计学差异，所以数据未展示。

2.4 Shkbp-1-/-小鼠骨髓中CD3+、CD4+细胞绝对计数升高

骨髓是免疫器官中枢免疫器官之一。主要作用为造血及B细胞分化发育提供场所，为再次体液免疫应答发生提供场所[19]。同样，制备单细胞悬液后，进行流式检测，将CD3阳性细胞进行设区域设门(图4A～图4B)，流式检测CD4 和CD8 细胞(图4C～图4D)。检测结果显示实验组小鼠CD3细胞绝对计数和百分比都有上升趋势，与正常小鼠对比(图4E～图4F)，差异明显(P<0.05)。实验组小鼠CD4细胞绝对计数也有上升趋势(图4G)，差异明显(P<0.05)。

2.5 Shkbp-1-/-小鼠脾脏中CD3+、CD4+、CD8+、CD4+CD8+双阳性细胞均显著减少

脾脏是机体最大的免疫器官，占全身淋巴组织总量的25%，含有大量的淋巴细胞和巨噬细胞，是机体细胞免疫和体液免疫的中心[20，21]。通过制备单细胞悬液，进行流式检测，将CD3 阳性细胞进行设区域设门(图5A～图5B)，流式检测CD4 和CD8 细胞代表图(图5C和图5D)。结果提示：Shkbp-/-小鼠脾脏中CD3+绝对计数降低(图5E)，并且有显著差异(P<0.001); CD4+绝对计数降低(图5F)，有显著差异(P<0.01);CD8+绝对计数降低(图5G)，有显著差异(P<0.001)。并且CD4+CD8+双阳性细胞也降低(图5H)，差异显著(P<0.001)。

注：A: Shkbp-1-/- 小鼠的构建，我们的小鼠为敲除了前六个外显子构建的；B：Shkbp-1-/- 小鼠的鉴定，2号为Shkbp-1+/+ 基因型小鼠，4号为Shkbp-1-/- 基因型小鼠，7号为Shkbp-1+/- 基因型小鼠。图1 Shkbp-1-/-小鼠的构建与鉴定Note. A: Construction of the Shkbp1 knockout mice, obtained by knocking out the 1-6 exons of the Shkbp1 gene; B: Identification of Shkbp-1-/- mouse. No. 2 is of Shkbp-1 +/+ genotype mouse, No. 4 is of Shkbp-1 -/- mouse genotype, No. 7 is of Shkbp-1+/- genotype mouse.Fig.1 Construction and identification of the Shkbp-1 - / - mice

图2 全自动血液细胞分类仪检测小鼠血液中白细胞分类变化Fig.2 Changes of leukocyte classification in the blood of mice detected with an automatic blood cell sorter. *P<0.05, **P<0.01

注：A, B: 流式检测C57 小鼠和Shkbp-1-/- 小鼠血液中CD3+ 淋巴细胞的区域设门; C、D：流式检测CD4和CD8细胞；E：CD4+CD8+ 双阳性细胞在CD3+ 细胞中的绝对计数；F：CD4+CD8+ 双阳性细胞占CD3+ 细胞的百分比;*p<0.05图3 Shkbp-/-小鼠血液中CD4+CD8+ 双阳性细胞降低Note. A, B: The gated area of CD3 + lymphocytes in the blood of C57 mice and shkbp-1-/- mice. C, D: CD4 and CD8 cells detected with flow cytometry; E: The absolute number of CD4 +CD8 + double-positive cells in CD3+ cells; F: Percentage of CD4+CD8+ double positive cells in CD3+ cells. *P<0.05.Fig.3 Count of CD4+CD8+ double-positive cells is decreased in the blood of Shkbp-1- / - mice

注：A、B: 流式检测C57 小鼠和Shkbp-1-/- 小鼠骨髓中CD3+ 淋巴细胞的区域设门；C、D：流式检测CD4和CD8细胞；E、F：CD3+ 细胞在骨髓细胞中的绝对计数及百分比；G：CD4+ 细胞在CD3+ 细胞中的绝对计数;* 表示P<0.05图4 Shkbp-/-小鼠骨髓中CD3+、CD4+升高Note. A, B: The gated area of CD3 + lymphocytes in the bone marrow of C57 mice and shkbp-1-/- mice.C, D: The CD4 and CD8 cells detected by flow cytometry. E,F: Absolute number and percentage of CD3+ cells in the bone marrow cells. G: Absolute number of CD4 + cells in the CD3+ cells, *P<0.05.Fig.4 The Count of CD3 +, CD4 + double-positive cells is increased in the bone marrow of Shkbp-1- / - mice

注：A、B: 流式检测C57 小鼠和Shkbp-1-/- 小鼠脾脏中CD3+ 淋巴细胞的区域设门; C、D：流式检测CD4 和CD8 细胞；E：CD3+细胞在脾脏细胞中的绝对计数；F、G、H：CD4+ 细胞、CD8+细胞、CD4+CD8+ 双阳性细胞在CD3+ 骨髓细胞中的绝对计数及百分比。*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001 图5 Shkbp-/-小鼠脾脏中CD3+、CD4+、CD8+、CD4+CD8+ 双阳性细胞降低Note. A, B: Flow cytometry detection of spleen CD3+ lymphocytes gated area in the C57 mice and Shkbp-1-/- mice. C, D: Detection of CD4 and CD8 cells by flow cytometry; E: Absolute number and percentage of CD3+ cells in spleen cells. F, G, H: Absolute count and percentage of CD4+ cells, CD8+ cells, and CD4+CD8+ double-positive cells in CD3+ cells, *P<0.05, **P<0.01, *** P<0.001Fig.5 The counts of CD3+, CD4+, CD8+, and CD4+CD8+ double positive cells are significantly reduced in the spleen of Shkbp-1-/- mice

图6 Shkbp-1-/-小鼠流式细胞技术检测结果Fig.6 Results of flow cytometry detection of Shkbp-1-/- mice

3 讨论

Shkbp1是调控EGFR降解相关的分子，我们的研究表明Shkbp基因小鼠免疫细胞和血液细胞出现异常。本研究结果显示，骨髓中CD3+、CD4+细胞数目升高，对照组血液中CD4+CD8+双阳性细胞数目降低，并且在脾脏组织中，流式结果显示其CD3+、CD4+、CD8+、CD4+CD8+双阳性细胞数目均呈下降趋势。(如图6)脾脏为最大的免疫器官，淋巴细胞数量丰富。一般来说，T细胞一旦成熟，就随血流离开胸腺进入外周免疫器官或外周血。但是，我们发现Shkbp1敲除小鼠的脾脏中各种免疫细胞均显著降低，提示Shkbp1在血液细胞的分化成熟调控中有重要作用。

在本研究中，我们采用的是专门设置检测小鼠血液的仪器程序来检测血常规，摒弃了原来用临床检测小鼠血常规的不足。但是，同我们以前的结果相比，对照组C57小鼠白细胞总数相差5.5×109个/L左右，淋巴细胞数量相差1.5×109个/L左右，单核细胞数量相差0.8×109个/L左右。其原因可能是：(1)在季节上，存在冬夏两个季节气温的差异。(2)在小鼠来源问题上，本实验所用的C57小鼠为广东省实验动物中心购买后于本实验室动物房内饲养繁殖使用，以前所用的C57小鼠于广东省实验动物中心购买后直接使用。 其原因有待进一步深入检测和了解，我们一直在关注该问题。

另外，还利用流式细胞仪检测细胞亚群。此次研究取材于8周大小的Shkbp-/-小鼠及对照组C57小鼠，对照组及实验组各取材6只。取其外周血进行流式测定，研究结果显示：实验组CD4+CD8+双阳性细胞数目降低，目前关于这一概念的相关报道较少。近年来，越来越多的证据表明：人类和其他动物外周血中存在少量CD4+CD8+双阳性T细胞，并具有独特的免疫活性。至于为什么实验组CD4+CD8+双阳性细胞数目降低，目前尚不清楚，仍需做进一步研究。

胚胎时期的脾脏曾一度为造血器官，可产生各种血细胞。出生后脾脏在异常情况下可髓外造血，但脾脏仍能制造淋巴细胞等与免疫相关系的细胞和物质。它有过滤血液的作用，还会对新生的红细胞进行必要的“修整”，并贮有大量的血小板。根据以往的报道，Shkbp1可以竞争抑制CIN85和c-Cbl的结合,从而阻断表皮生长因子受体的内吞和降解,也能上调表皮生长因子受体相关的报告基因的转录水平,那么是否Shkbp1可能也是通过与CIN85竞争引起了c-Cb-1变化，参与了血液的分化，有待进一步研究。

总之，我们研究结果表明Shkbp1参与血液的成熟分化，并影响了免疫细胞数量的改变，为深入了解血液的分化奠定了基础。

4 致谢

本研究由国家自然基金(No.81472336 和No.31471290)和广东省科技计划(2015A030302086、201-4A020212313和2015A030302085)共同资助，感谢广东省实验动物监测所罗挺老师在流式检测方面给予的支持。

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Effects of Shkbp1 deletion on mouse T lymphocyte subsets

LIU Qing, ZHANG Xiao-han, YANG Ming-ming, ZHOU Ze-qi, WANG Li-jing, LI Jiang-chao

(Guangdong Pharmaceutical University，School of Basic Courses, the Vascular Biology Institute, Guangzhou 510006，China)

Objective Shkbp is also called Shkbp1, can competitively inhibit binding CIN85 and c-Cbl, thereby blocking the epidermal growth factor receptor (EGFR) endocytosis and degradation, to play a role in tumor promotion. This study aims to explore the changes in blood cell classification and T cell subsets in blood, bone marrow, and spleen in Shkbp1-deletion (Shkbp-1- / -) mice. Methods Shkbp-1- / -transgenic mice were identified by PCR genotyping. Blood cell classification was performed using an automatic classification system. Flow cytometry was used to detect the T lymphocyte subsets in the blood, bone marrow, and spleen of Shkbp-1- / -and control mice. Results Routine blood examination showed that neutrophils and eosinophils tended to increase and showing significant differences, and there was no significant difference in lymphocytes. The flow cytometry results showed that there was a decrease of CD4+CD8+double positive cells and increase of bone marrow CD3+and CD4+cells in the control group. However, there was a decreasing trend of CD3+, CD4+, CD8+, and CD4+CD8+cellsin the spleen tissues. Conclusions Shkbp1 is involved in the maturation and differentiation of blood cells, and affects the number of immune cells. This study lays a foundation for the study of how Shkbp1 is involved in the differentiation of blood cells.

Shkbp-1; Leukocytes; T cell subsets; CD3+, CD4+, CD8+, CD4+CD8+lymphocytes；Genetically engineered mice

国家自然基金(No.81472336 和No.31471290)和广东省科技计划(2015A030302086 和2014A020212313) 共同资助。

刘擎(1992-)，女，研究生，专业：病理学与病理生理学。Email:liuqing6620@163.com。

李江超(1976-)，男，副研究员，研究方向：肿瘤微环境。Email:lijiangchao1234@163.com。

R-33

A

1671-7856(2017) 04-0056-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.04.010

2016-11-16