拟南芥35S:MS606/myb26转基因植物的鉴定

宋欣，赵淑清

（山西大学生物技术研究所，山西太原030006）

拟南芥35S:MS606/myb26转基因植物的鉴定

宋欣，赵淑清

（山西大学生物技术研究所，山西太原030006）

ms606是山西大学植物生殖发育实验室创制的雄性不育突变体，该突变体具有药室内壁次生加厚缺陷，导致花药不能开裂。而转录因子MYB26在药室内壁次生加厚过程中发挥着重要的调控作用。为了研究MS606和MYB26之间的关系，我们将35S：MS606融合基因在农杆菌介导下转化植物myb26/MYB26杂合体，通过潮霉素抗性筛选，结果获得T1转化植株；并通过在基因组水平的PCR检测和RNA水平的半定量RT-PCR检测，获得纯合的35S：MS606/myb26转基因植株。该材料的获得为深入研究MS606和MYB26基因在调控药室内壁次生加厚途径中的关系奠定了良好基础。

拟南芥；转基因；MS606；MYB26；基因表达

植物转基因技术是采用基因工程手段将外源基因重组到植物表达载体，然后转入植物中，使新基因在植物细胞内整合、表达，并能将外源基因遗传给后代，由此获得基因改良植物，使之稳定遗传并赋予植物新的性状[1]。这一技术克服了植物有性杂交的限制，使基因交流的范围无限扩大，是进行基因功能研究和植物遗传改良的重要工具。自1986年世界上第1例转基因植物问世以来，转基因植物迅猛发展，在抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等方面取得了一定的成就[2-3]。

花药发育和花粉形成是植物完成世代交替的重要环节，而花粉粒作为植物的雄配子体，在有性生殖过程中发挥着重要作用。拟南芥与大多数开花植物相同，花药壁由表皮、药室内壁、中层和绒毡层4个细胞层组成[4]。花药开裂是一个极其复杂的过程，包括表皮薄弱处细胞溶解产生裂口，花药壁的回缩使裂口加宽以释放花粉等事件。在野生型中，药室内壁里纤维素和木质素合成积累产生次生加厚[5-6]，药室内壁的次生加厚在花药开裂过程中起着关键作用，可为花药开裂提供一种机械力量：首先药室内壁细胞膨胀使裂口开裂，随后药室内壁干燥脱水使细胞壁特异收缩。

MYB26是花药中以细胞特异的模式调控药室内壁发育和次生加厚的一个关键因子[7-9]。在myb26突变体中，药室内壁细胞的扩张和次生加厚发生异常，随后的药室内壁也没有收缩，导致花药不开裂不能释放花粉。MYB26过表达导致拟南芥表皮组织异位次生加厚[9]。MYB26作用于木质素合成途径的上游，通过调节次生加厚相关基因IRREGULAR XYLEM1（IRX1），IRX3，IRX8和IRX12，NAC SECONDARY WALL THICKENING PROMOTING FACTOR1（NST1）和NST2等的表达，进而调节次生加厚的过程[9]。ms606是山西大学植物生殖发育实验室创制的拟南芥雄性不育突变体，该突变体由于自花授粉失败而产生短小的角果，但是通过人工授予有活力的花粉可以挽救其不育表型。前期的试验结果显示，ms606植株花药开裂也存在缺陷。

本研究利用山西大学植物生殖发育实验室构建的35S启动子驱动的融合MS606 cDNA的植物表达载体pGWB5-MS606，通过农杆菌EHA105介导，用花苞浸染法转化了杂合的myb26/MYB26突变体，并对转基因植物进行基因组水平的PCR检测和RNA水平的半定量RT-PCR检测，旨在得到纯合的35S：MS606/myb26转基因植物，以便确定过表达MS606是否对myb26的表型产生影响，从而探讨拟南芥MS606和MYB26基因在调控花药发育尤其是药室内壁次生加厚过程中的关系，对于进一步提高人们对花粉发育生物学过程的认识具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）myb26突变体（SALK_112372，Columbia，Col-0生态型）是从英国诺丁汉拟南芥种子库中心获得。

野生型拟南芥（Columbia，Col-0生态型）种子由山西大学植物生殖发育实验室保存。培养条件：温度18～22℃，湿度50%～70%，光暗周期16 h/8 h。1.1.2菌株和质粒pGWB5-MS606由山西大学植物生殖发育实验室构建，农杆菌EHA105感受态细胞由山西大学植物生殖发育实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 人工杂交获得myb26/MYB26杂合体以拟南芥突变体myb26植株作为母本、野生型作为父本，当myb26植株花蕾刚刚露白时，小心剥去花萼、花瓣和雄蕊，露出雌蕊，取刚盛开的野生型花的雄蕊，授粉到myb26植株的雌蕊柱头上并做好标记。对杂交成功的角果，成熟后单独收获。

1.2.2 pGWB5-MS606重组质粒转化拟南芥myb26/ MYB26杂合体

1.2.2.1 感受态农杆菌EHA105的转化采用液氮冻融方法[10]将pGWB5-MS606质粒转入农杆菌EHA105中，在含（Rif 50 mg/L和Kan 50 mg/L）抗性的LB固体培养基上筛选阳性克隆，并用PCR法鉴定。

1.2.2.2 花苞浸染法转化拟南芥植株将经过鉴定的pGWB5-MS606重组质粒采用农杆菌介导的花苞浸染法[11]转化拟南芥myb26/MYB26杂合体。转化步骤参照CLOUGH等[12]的研究方法，即取2 mL菌液接种于加有相同抗性的200 mL LB液体培养基中，28℃200 r/min振荡培养至OD260＝1.0。离心后，去上清，菌体重悬浮于5%蔗糖溶液中，加入Sliwet L-77，至终浓度0.05%。将拟南芥花序倒浸在菌液中约1 min。然后用塑料膜覆盖以保持湿度，暗处过夜。第2天放回培养室内正常条件下培养直到成熟，将收获的T1拟南芥种子用于筛选转基因植株[13-14]。

1.2.3 转基因拟南芥的筛选和鉴定转基因T1种子用70%乙醇消毒5 min；用无菌水洗涤3～5次后，均匀涂播于含有50 mg/L潮霉素的1/2 MS固体培养基上；4℃春化3天，移入培养室。14 d后将平板上存活的幼苗转入土中，覆膜保湿7 d。

采用蔗糖法[15]提取拟南芥基因组DNA，略做改动。即收集生长14 d左右的拟南芥幼叶样品于冰置的100 μL的蔗糖溶液（50 mmol/L Tris-HCl，pH值7.5，300 mmol/L NaCl，300 mmol/L蔗糖）中，用枪头将叶片压碎，在PCR仪上99℃加热10 min，然后6 000 r/min瞬时离心，用1 μL的上清进行PCR反应。鉴定纯合的myb26 T-DNA突变体所用引物为：T-DNA左边界引物LBb3和MYB26基因座位特异引物MYB26-RP和MYB26-LP；鉴定35S：MS606转基因植株所用引物为MS606-Fv和GFP-pGWB5-R。引物序列列于表1。

1.2.4 RT-PCR检测转基因植物中MS606和MYB26的表达取经基因型分析筛选出的纯合转基因植株花蕾，利用TaKaRa的RNAisoPlus试剂提取总RNA。用NanoDrop 2 000超微量分光光度计测定RNA的浓度。利用PrimeScriptTMII RT试剂盒对2 μg的RNA合成cDNA。然后，利用MS606基因的特异引物MS606-F和MS606-R及MYB26基因的特异引物MYB26-F和MYB26-R，进行RT-PCR检测MS606和MYB26的表达，ACTIN2基因作为内参。引物序列列于表1。扩增条件：94℃3 min；94℃3 min，58℃30 s，72℃1 min，25个循环；最后72℃延伸5 min。扩增产物采用1.0%的琼脂糖凝胶电泳分析。

表1 引物序列

1.2.5 转基因植株35S：MS606/myb26的表型分析

植物转入生殖生长后，观察35S：MS606/myb26转基因植株的角果是否能够正常伸长，产生种子。同时种植野生型和myb26突变体作为对照。

2 结果与分析

2.1 35S∶MS606/myb26转基因植株的鉴定

利用农杆菌介导的花苞浸染法，将pGWB5-MS606转化拟南芥myb26/MYB26杂合体。收获的种子在含有50 mg/L潮霉素的1/2 MS培养基上进行抗性筛选，得到转化植株40株。抗性植株转入土中继续培养。采用蔗糖提取法提取这些抗性植株的基因组DNA，进行分析鉴定。

首先，利用“三引物法”鉴定纯合的T-DNA插入突变体。SALK_112372株系，T-DNA插入位于MYB26转录物的第3外显子上。利用T-DNA插入两端MYB26基因特异的引物MYB26-LP和MYB26-RP，对筛选出的植株进行PCR鉴定。MYB26-LP和MYB26-RP只能在野生型或杂合体中扩增出产物；在T-DNA插入纯合体中，由于T-DNA本身的长度约为17 kb，过长的模板会阻抑目的基因特异扩增产物的形成。PCR鉴定结果显示，有8个单株没有MYB26特异的PCR产物，表明这些株系有T-DNA插入（图1-A，C箭头所示）；利用T-DNA左边界引物LBb3和MYB26基因座位特异引物MYB26-RP对这些株系进行扩增，结果显示，这8个单株有T-DNA插入的特异性扩增条带（图1-B，D箭头所示）。根据图1的PCR结果可以确定，这8个单株为纯合T-DNA插入突变体myb26。

然后，利用重组质粒pGWB5-MS606特异性的引物2g23470-1230-F和GFP-pGWB5-R，对这8株具有纯合T-DNA插入的myb26突变体进行PCR鉴定，转基因植株检测到900 bp的目标条带（图2），说明pGWB5-MS606已经被整合到拟南芥基因组中，所获得的抗性植株为转化株。

2.2 转基因植株中MS606和MYB26的表达分析

对筛选到的35S：MS606/myb26转基因植株，采用半定量RT-PCR，分别利用MS606和MYB26特异的引物进行基因表达分析，结果显示，转基因植株中MYB26的表达显著降低（图3-A），说明所转化的植物的背景的确是MYB26敲除的纯合突变体；而MS606基因的表达水平得到了提高（图3-B），表明MS606基因在myb26突变体中得到了过表达。

2.3 35S：MS606/myb26转基因植株的表型分析

对35S：MS606/myb26转基因植株、野生型和myb26突变体的表型进行观察，结果发现，与野生型相比，35S：MS606/myb26转基因植株角果短小而雄性不育；与myb26相比，35S：MS606/myb26转基因植株的角果发育没有明显的变化（图4），MS606基因不能恢复myb26雄性不育的表型。

3 讨论

DUF647蛋白家族是在真核生物中广泛存在的、高度保守的蛋白家族，在拟南芥、水稻和苔藓植物中都有同源基因。拟南芥中有6个DUF647蛋白家族成员[16]。最近的研究表明，RUS1和RUS2在拟南芥幼苗形态发生和生长素极性运输中发挥着重要作用[17-20]。MS606属于DUF647蛋白家族的一个成员；ms606突变体雄性不育，其药室内壁次生加厚发生异常，花药不能开裂。

转录因子MYB26是调控药室内壁次生加厚相关基因表达和决定特定细胞次生加厚的一个关键因子[9]，在myb26突变体中，花药的药室内壁次生加厚和木质化异常。本试验将过表达MS606的重组质粒通过农杆菌介导法转入myb26×Col杂交产生的F1杂合体植株中，通过抗性筛选，获得了T1转化植株；通过对T2基于PCR的基因型分析，筛选得到了纯合的35S：MS606/myb26转基因植株。表达分析显示，转基因植株花蕾中MS606表达升高，MYB26表达明显下调。对转基因植株的表型观察发现，过表达MS606对myb26突变体的表型没有影响，雄性不育表型不能逆转，推测MYB26和MS606基因可能通过不同的途径发挥作用。尽管目前已经鉴定了药室内壁次生加厚过程的一些重要的调控因子，但是对于其具体调控机制仍不是很清楚。纯合35S：MS606/myb26转基因植株的获得，为进一步分析MS606和MYB26在调控花药药室内壁次生加厚中的作用提供了有价值的试验材料。

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Identification of35S:MS606/myb26Transgenic Plants inArabidopsis thalianaL.

SONGXin，ZHAOShuqing
（Institute ofBiotechnology，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

ms606 is a male sterile mutant with defect in anther dehiscence.Anthers fromthe ms606 plants fail todehiscence due to loss ofendotheciumsecondarythickening.The transcription factor MYB26 plays a regulatoryrole in endothecium lignification.Therefore, the relationship between MS606 and MYB26 is deserved to investigate.The 35S：MS606 cDNA construct was introduced into the myb26 background to determine whether MS606 overexpression had any effect on myb26 mutant phenotype.The transgenic plants were selected by hygromycin resistance and confirmed by PCR genotyping.RT-PCR showed that MS606 was overexpressed in homozygous 35S：MS606/myb26 transgenic plants.This study has provided a basis for further investigating the relationship between MS606 and MYB26 on endotheciumsecondarythickeningin Arabidopsis.

Arabidopsis thaliana L.;transgene;MS606;MYB26;gene expression

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.05.02

Q943.2

：A

：1002-2481（2017）05-0680-04

2017-01-27

国家自然科学基金项目（31170273）；山西省回国留学人员科研资助项目（2015）

宋欣（1990-），女，山西潞城人，在读硕士，研究方向：植物分子生物学。赵淑清为通信作者。