传统藏药渣驯丸对四氯化碳引起小鼠急性盯损伤的保护作用

索南邓登　童丽　热增才旦等

摘要：目的探讨渣驯丸对CCl4引起小鼠急性肝损伤的保护作用。方法将60只昆明种雄性小鼠随机分为6组：正常对照组、模型组、阳性对照组、渣驯丸高、中、低剂量组（1.00g/kg）、（0.50g/kg）、（0.25/kg）。给药组给予渣驯丸灌胃，每天灌胃两次，连续6 d，正常对照组和CCl4模型组给予等体积生理盐水灌胃。在第6 d灌胃末次给药两小时后，除正常对照组外，其余组均腹腔注射0.1%CCl4石蜡油溶液并在24 h后取材，检测血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）活力以及肝组织中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）的活力及含量。结果渣驯丸小剂量组与CCl4模型组相比，血清中ALT、AST的含量明显降低（P

关键词：藏药；渣驯丸；急性肝损伤；抗氧化；四氯化碳

随着社会的发展，肝脏的功能受多种因素的影响，容易造成酒精肝、脂肪肝、肝脏纤维化、肝硬化、甚至肝癌等严重疾病。所以肝保护成了现代医学中急需解决的课题。四氯化碳在多项诱导药物中是最为经典的一种。研究表明，小鼠CCl4急性肝损伤动物模型是经典的氧化性肝损伤动物模型之一。傳统藏药渣驯丸，为常用藏药制剂，收藏于藏医典籍和文献资料，其应用已有1300多年历史的，具有广泛的民间用药基础。渣驯丸由渣驯膏、红花、木香、诃子（去核）、甘青青兰药味组成，具有清肝热的功效，主要用于慢性肝炎、乙型肝炎等。本实验研究根据现代医学及传统医药在肝损伤中研究进展作为其立题依据，探讨渣驯丸对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的的影响。建立正确而有效的动物模型，以ALT，AST，MDA，SOD等指标来观察，从而进一步了解机制，为临床应用提供可靠的理论和实验依据。

1.资料与方法

1.1一般资料 藏药渣驯丸：购自青海省藏医院（批号：20070126）；超氧化物岐化酶（SOD，批号：FGDJ2014071556）；丙二醛（MDA，批号：GDJ2014071009）；丙氨酸氨基转移酶（ALT，批号：EXCl4070992）门冬氨酸氨基转移酶（AST，批号：ECTl4070992）；考马斯亮兰总蛋白定量（批号：BXCl4070112）均购自南京建成生物研究；

1.2仪器 SHB-IIIA循环水式多用真空泵（上海豫康科教仪器设备有限公司），DZF-150型恒温真空干燥箱（郑州长城科工贸有限公司），DNM-9602酶标分析仪（北京普朗新技术有限公司），R2060旋转蒸发器（上海申生科技有限公司），HH-W420数显三用恒温水箱（金坛市科技仪器有限公司），4-M-4型超声振荡器（昆山市超声仪器有限公司），SUNRISE分光光度计（日本日立株式会社），HHHS-65型电热恒温水浴箱（上海衡平器仪表厂），HITACHI U-1900离心机（金坛市科析仪器有限公司），BT224S电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）。

1.3动物 8 w龄昆明种小鼠70只，雄性，体重（20_+2）g，购自甘肃兰州大学医学院（合格证号；SCXK-（甘）2013-0002）。分笼饲养于青海大学医学院实验动物中心。饲养条件：光照明暗12 h交替，自由饮水，温度：（23±2）℃，适应性喂养3 d。

1.4方法

1.4.1药物提取 取100 g渣驯丸研磨成粉末，加入1000 ml的蒸馏水，煎煮15 min，过滤，连续两次，合并滤液、浓缩滤液至100 ml，得到渣驯丸提取液（含生药1 g/ml），4℃保存。

1.4.2动物分组 小鼠70只，随机分为6组：空白组、模型组、阳性组（联苯双酯，150 mg/kg）、渣驯丸高（1.00 g/kg）、中（0.50g/ks）、低（0.25 g/kg）剂量组，每组10只，雌雄各半。

1.4.3给药方法 给药组每日灌胃给药，空白组与模型组给予等体积生理盐水，剂量0.2 ml/10 g，2次，d，连续14 d。

1.4.4动物造模 在给药2 h后，除正常对照组外，其余各组均腹腔注射0.1%CCl4石蜡油溶液（5 ml/kg）。

1.4.5血清中AST和ALT的检测 在腹腔注射0.1%CCl4石蜡油溶液24 h后，摘眼球取血，得到的血液离心10 min，2500 r/min，用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中的AST（谷草转氨酶）和ALT（谷丙转氨酶）的含量。

1.4.6肝脏组织中抗氧化酶活力检测 在摘眼球取血完成后，脊椎脱臼处死动物，剖取小鼠肝脏，制备20%肝组织匀浆，2500 r/min，离心15 min。参照试剂盒方法检测上清中超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的活力及含量。

1.4.7肝组织形态学检查 在摘眼球取血完成后，脊椎脱臼处死动物，剖取小鼠肝脏，取右外侧叶用生理盐水冲洗干净，立即放入10%中性甲醛溶液固定。进行包埋处理，切片厚度为4um，HE染色，显微镜观察肝组织形态。

1.5统计学分析 采用SPSS 18.0软件对数据进行统计处理，所有数据均以均数±标准差（x±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，若方差不齐采用秩和检验，检验水准a=0.05。

2.结果

2.1渣驯丸对CCl4引起急性肝损伤小鼠血清ALT、AST含量的影响 结果显示，渣驯丸小剂量组能降低CCl4引起急性肝损伤小鼠血清ALT的含量（P<0.05），渣驯丸小剂量与中剂量组能够升高AST的含量（P<0.05），见表1。

2.2渣驯丸对CCl4引起急性肝损伤小鼠血清抗氧化酶活力的影响 结果显示，模型组SOD活力降低，说明造模成功，渣驯丸小剂量组对SOD的活力升高（P<0.05），但渣驯丸大剂量组能够降低肝损伤小鼠MDA含量（P<0.05），见表2。

2.3渣驯丸对CCl4引起急性肝损伤小鼠肝脏及肾脏形态学观察，肝脏形态学观察，见图1、图2、图5、图6；肾脏形态学观察，见图3、图4、图7、图8。

3.讨论

本实验研究了藏药渣驯丸对CCl4引起急性肝损伤小鼠的保护作用，CCl4是经典的诱导肝损伤的方法之一，CCl4经肝脏中的代谢酶CYP450代谢后产生一系列的氧自由基，加剧脂质代谢，产生大量MDA。所以增强机体的抗氧化活性是保护肝脏的重要途径之一，倪琳嗍等人分离测定了渣驯丸中主要的成分羟基红花黄素A、没食子酸、马兜铃酸A的含量。这几种有效成分具有抑制细胞凋亡、抗肿瘤等作用，本实验测定了肝损伤小鼠的SOD活力和MDA含量，SOD与MDA是反应机体抗氧化能力的经典指标，SOD能够减轻脂质过氧化反应，维持自由基平衡。MDA引起脂质过氧化反应，导致细胞膜通透性改变释放出大量的AST及ALT，因此测定血清中两者的含量有重要意义。藏药渣驯丸小剂量组能够增强SOD的活力（P<0.05）。降低了ALT的含量，大剂量组能够降低MDA的含量（P<0.05）。电镜观察显示渣驯丸对CCl4引起急性肝损伤小鼠肝脏及肾脏形态学观察，应用CCl4后，小鼠肝细胞结构明显受损，渣驯丸各剂量组对肝细胞均有不同程度的保护作用。

藏药复方成分不明，质量标准难以确定是藏药发展的瓶颈，实验中大小剂量组所反映的指标说明藏药渣驯丸对肝损伤具有一定的量效关系，其机制不明，值得进一步研究。