婴幼儿配方羊奶粉中乳铁蛋白含量测定

文/李则均

（黑龙江完达山乳品有限公司）

婴幼儿配方羊奶粉中乳铁蛋白含量测定

文/李则均

（黑龙江完达山乳品有限公司）

以食品安全国家标准《食品中乳铁蛋白的测定（征求意见稿）》为参考，优化预处理步骤和梯度洗脱条件，肝素亲和柱净化，紫外高效液相色谱法测定婴幼儿配方羊奶粉中乳铁蛋白含量。检测波长280 nm，乳铁蛋白标准品出峰时间9.475 min。乳铁蛋白标准品工作液浓度50～250 μg/mL，在此范围内线性回归方程y =129.67x-7.4719，R2＞0.9991。乳铁蛋白定性重复性RSD%（n=6）为0.074，定量重复性RSD%（n=6）为0.996。乳铁蛋白加标回收率在93.4%～99.1%，平均回收率96.7%。

婴幼儿配方羊奶粉；乳铁蛋白；肝素亲和柱；紫外高效液相色谱

乳铁蛋白是一种非常重要的非血红素铁结合单体糖蛋白。乳铁蛋白不仅参与铁的转运，而且具有广谱抗菌、抗病毒、抗真菌、抗氧化、抗辐射、抗过敏、抗癌和调节免疫系统的功能。研究表明，人乳喂养的婴儿较婴幼儿配方奶粉喂养的婴儿抵抗力更高，不易患各种传染性疾病，主要是由于母乳中含有更多的乳铁蛋白、免疫球蛋白等多种活性蛋白，因此普通婴幼儿配方奶粉中合理的添加乳铁蛋白尤为重要。羊奶与牛奶相比，羊奶的脂肪颗粒体积更小，维生素和微量元素含量更高，更易被婴幼儿消化吸收，因此婴幼儿配方羊奶粉越来越受到市场青睐。婴幼儿配方羊奶粉中添加乳铁蛋白有着更广泛的前景，本文旨在确定一种准确、高效的婴幼儿配方羊奶粉中乳铁蛋白含量的测定方法。

目前乳铁蛋白的测定方法主要有分光光度法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附法、高效亲和色谱法、高效毛细血管电泳法以及表面等离子共振技术等。分光光度法测定乳铁蛋白含量准确性差。酶联免疫吸附法、高效亲和色谱法和高效毛细血管电泳法样品前处理操作繁琐，预处理时间长。高效液相色谱法测定准确性好，亲和柱处理目标峰明确，干扰峰少，前处理简单、时间短，因此本文采用肝素亲和柱预处理净化样品，紫外高效液相色谱柱分离测定婴幼儿配方羊奶粉中乳铁蛋白含量。

1 材料方法

1.1 仪器与药品材料

1.1.1 仪器

紫外高效液相色谱：美国，PE生产，型号PE Flexar。

数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司，型号KQ-1000DB。

冷冻离心机：SIGMA生产，型号3K15。

pH计：METTLER TOLEDO生产，型号MP220。

涡旋振荡器：IKA VORTEX生产，型号GENIUS 3。

1.1.2 药品材料

超纯水：Millipore纯水机制备。

三氟乙酸：CNW生产，色谱纯，浓度0.1%。

乙腈：DiKMA生产，色谱纯。

乙醇溶液（20%）：乙醇DiKMA生产，色谱纯。

磷酸：科密欧生产，优级纯。

磷酸氢二钠溶液（0.20 mol/L）：称取28.4 g磷酸氢二钠（科密欧生产，优级纯），加水溶解，用磷酸调pH值至8.00±0.50，加水定容至1 000 mL。

磷酸氢二钠-氯化钠溶液：称取7.1 g磷酸氢二钠，58.4 g氯化钠（科密欧生产，优级纯），加水溶解，用磷酸调pH值至8.00±0.50，加水定容至1 000 mL。

乳铁蛋白标准品：乳铁蛋白储备液，浓度10 mg/mL；乳铁蛋白中间液，浓度0.5 mg/mL；乳铁蛋白工作液，浓度分别为0、50、100、150、200、250 μg/mL。

肝素亲和小柱（1 mL）：Pharmacia生产，Hitrap Heparin HP。

1.2 预处理方法

1.2.1 提取

准确称取婴幼儿配方羊奶粉1.0 g于50 mL带盖离心管中，加入10 mL 40～45 ℃磷酸氢二钠溶液。涡旋振荡使样品完全溶解后，再涡旋振荡30 s，4 ℃ 10 000 r/min离心10 min。移取上层清液，再加5 mL磷酸氢二钠溶液重复操作1 次，合并2 次液体作为提取液备用。

1.2.2 净化

肝素亲和小柱先加入5 mL磷酸氢二钠溶液平衡，然后加入样品提取液，待样液完全流出后，再用10 mL磷酸氢二钠溶液淋洗，弃去全部流出液，用2.5 mL磷酸氢二钠-氯化钠溶液洗脱，收集全部流出液，用磷酸氢二钠-氯化钠溶液定容至2.5 mL。过0.45 μm微孔水相滤膜，进行液相色谱检测分析。

1.3 分离条件

1.3.1 色谱柱

Proteonavi HPLC PACKED COLUMN C4，4.6 μm×150 mm。

1.3.2 流动相

A：0.1%三氯乙酸；B：乙腈。梯度洗脱，洗脱条件见表1。

1.3.3 进样量

50 μL。

1.3.4 检测波长

280 nm。

1.3.5 柱温

30 ℃。

2 结果分析

2.1 婴幼儿配方羊奶粉中乳铁蛋白目标峰的确定

乳铁蛋白标准品溶液浓度为100 μg/mL的液相色谱图见图1。如图1所示，乳铁蛋白标准品的液相色谱显示为单峰，出峰时间为9.475 min，在该保留时间内无梯度洗脱物和试剂杂峰干扰，具有很好的相应强度，基线稳定。

表1 梯度洗脱条件

图1 乳铁蛋白标准品溶液色谱图

图2 婴幼儿配方羊奶粉中乳铁蛋白色谱图

婴幼儿配方羊奶粉样品中乳铁蛋白液相色谱图见图2。图2显示，样品中乳铁蛋白的保留时间为9.413 min。样品预处理采用肝素亲和小柱，色谱图中除去梯度洗脱和试剂杂峰外，无任何干扰杂峰。婴幼儿配方羊奶粉成分复杂，含有大量的酪蛋白，它的存在对乳铁蛋白的测定具有较大干扰，肝素亲和小柱有效地去除了大量杂质，对乳铁蛋白进行纯化和浓缩吸收，对提高检测灵敏度起到了很好的作用。

2.2 标准曲线

以乳铁蛋白标准工作液的浓度为横坐标，以不同浓度标准工作液注入高效液相色谱仪测定的对应峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。不同浓度工作液与对应峰面积见表2，标准曲线见图3。线性回归方程为y =129.67x-7.4719，R2＞0.9991，说明乳铁蛋白工作液浓度在50～250 μg/mL时，乳铁蛋白峰面积与质量浓度之间存在良好的线性关系。本方法的检出限为24 μg/mL，定量限为8 μg/mL。

2.3 方法的重现性与回收率

2.3.1 重现性

婴幼儿配方羊奶粉中乳铁蛋白的测定叠加图见图4，样本数为6，乳铁蛋白定性定量重复性见表3。通过图4和表3表明，采用此方法测定婴幼儿配方羊奶粉中乳铁蛋白含量，试验重现性良好。

2.3.2 回收率

选取没有添加过乳铁蛋白的全脂羊奶粉（样品1）做空白对照，选取市场销售的某婴幼儿配方羊奶粉（样品2）中乳铁蛋白平均含量为30 mg/100 g，加标回收试验分别添加乳铁蛋白含量为10、30、50 mg/100 g，测得回收率结果见表4。

表2 乳铁蛋白标准工作液浓度与对应峰面积

乳铁蛋白含量为10 mg/100 g的加标回收率较低，平均值为94.3%（样品1和样品2平均值）；乳铁蛋白含量为30 mg/100 g的加标回收率平均值为97.0%；乳铁蛋白含量为50 mg/100 g的加标回收率较高，平均值为98.8%。但是加标回收试验的添加量不能过高，因为肝素亲和柱（1 mL）的柱过载量不能超过1 g/100 g，添加量过大会造成肝素亲和柱饱和，导致乳铁蛋白无法被吸附而损失，影响回收率。本试验的添加量分别按照样品含量的0.3 倍、1.0 倍、1.6 倍添加，在标准曲线范围内，又没有超过肝素亲和柱添加量，因此回收率较稳定，平均回收率为96.7%。

图3 乳铁蛋白标准曲线

表3 婴幼儿配方羊奶粉中乳铁蛋白定性定量重复性结果表

图4 婴幼儿配方羊奶粉中乳铁蛋白的测定叠加图

表4 回收率试验

3 讨论

婴幼儿配方羊奶粉成分十分复杂，含有大量的乳糖和酪蛋白，这些物质对乳铁蛋白的测定产生了较大的干扰，本文采用肝素亲和柱法净化浓缩后，乳铁蛋白目标峰明确。肝素亲和柱的主要成分为肝素琼脂糖，其作用原理主要是固定化肝素的活性调节分子与乳铁蛋白结合，同时肝素的聚阳离子特性，使其具有离子交换的作用。肝素由于其生理特性，pH值的范围一般为5～10，因此试验时溶解乳铁蛋白和洗脱用的离子缓冲溶液要严格控制pH值范围。

为了节约试验成本，肝素亲和柱可以反复使用，在第1次使用完毕后，用50～100 mL的磷酸氢二钠溶液（0.20 mol/L）反复冲洗，最后保存在20%乙醇溶液中。一根肝素亲和柱可以反复使用2～3 次，试验表明肝素亲和柱后2 次的使用吸附率一般在85%以上。为了提高检测准确率，肝素亲和柱从4 ℃冰箱拿出后不能马上使用，要缓到室温20～25 ℃，再注入提取液时，过柱流速一般控制在10～20 mL/min，使乳铁蛋白与肝素上带负电的硫酸盐和羧酸基团能充分反应，以提高回收率。

本文以食品安全国家标准《食品中乳铁蛋白的测定（征求意见稿）》为参考，优化了预处理试验步骤，节省了检测时间；改变了梯度洗脱条件，使乳铁蛋白得到更好的分离，基线更稳定。

4 结论

本文采用肝素亲和柱净化，紫外高效液相色谱法测定婴幼儿配方羊奶粉中乳铁蛋白含量，采用Proteonavi HPLC PACKED COLUMN C4，4.6 μm×150 mm色谱柱，以0.1%的三氯乙酸溶液和乙腈梯度洗脱，在乳铁蛋白工作液浓度为50～250 μg/mL时准确度高，重现性较好，适合工厂大批生产婴幼儿配方羊奶粉及其它奶制品等添加乳铁蛋白含量的测定。C

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Determination of the Content of Lactoferrin in Infant Formula Sheep Powder

LI Ze-jun
（Heilongjiang Wondersun Dairy Co. Ltd.）

The determination of lactoferrin in food （draft for comments） was taken as the reference in the national food safety standard. The pretreatment and gradient elution conditions were optimized. The heparin affinity column was used for the determination of lactoferrin in infant formula sheep powder. Detection wavelength was 280 nm，lactoferrin standard peak time was 9.475 min. Lactoferrin standard working solution concentration was 50～250 μg / mL，in this range linear regression equation was y=129.67x-7.4719，R2＞0.9991. The qualitative repeatability RSD% （n =6）of lactoferrin was 0.074 and the quantitative repeatability RSD%（n=6）was 0.996. The recoveries of lactoferrin were 93.4%～99.1%，and the average recovery was 96.7%.

infant formula sheep powder；lactoferrin；heparin affinity column；ultraviolet high performance liquid chromatography

李则均（1983-），女，工程师，主要从事质量分析工作。

2017-02-03）