硫化氢对野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肥大细胞及IL-6的影响

李红岩，尹宗涛，赵科研

(沈阳军区总医院 心血管外科，辽宁 沈阳110840)

硫化氢对野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肥大细胞及IL-6的影响

李红岩，尹宗涛，赵科研*

(沈阳军区总医院 心血管外科，辽宁 沈阳110840)

目的 探讨硫化氢对野百合碱(MCT)诱导的肺动脉高压(PH)大鼠肥大细胞及IL-6的影响。方法 将24只雄性SD大鼠随机分为MCT组、H2S组和control组，每组8只。MCT组：野百合碱60 mg/kg一次性腹腔注射；H2S组野百合碱60 mg/kg一次注射，并且每天腹腔注射NaHS(56 μmol/kg) 1 ml；control组分别注射等量生理盐水。3周后测定大鼠肺动脉平均压力(mPAP)、右心肥厚指数[RV/(LV+S)]；甲苯胺蓝染色测定大鼠肺组织切片中肥大细胞数量及脱颗粒肥大细胞比例；检测大鼠血浆中IL-6及H2S的含量。 结果 3周后，MCT组大鼠肺动脉平均压力、右心肥厚指数明显高于control组(P<0．05)，肥大细胞计数和脱颗粒肥大细胞比例明显升高，血浆IL-6升高，而H2S降低。而H2S组能明显抑制肺动脉平均压力增高及右心肥厚指数的增加，肥大细胞计数较MCT组降低(单位：n/10 mm2，12.14±3.72 比24.67 ±4.46，P<0.05)；脱颗粒肥大细胞比例降低[(29.31±6.71)% 比(52.15±9.65)%，P<0.05]；同时H2S组与MCT组相比，血浆中IL-6降低，H2S升高，P<0.05。结论 硫化氢可能通过抑制肥大细胞聚集、脱颗粒，以及抑制IL-6的释放抑制肺动脉高压形成。

硫化氢；野百合碱；肺动脉高压；肥大细胞；白介素-6

(ChinJLabDiagn,2017,21:0689)

肺动脉高压(PH)是临床中常见且严重危害生命健康的心血管疾病之一，有研究表明肥大细胞在肺高压的发生、发展中扮演着重要的角色[1],肥大细胞可以释放IL-6等炎症因子，而且IL-6已经被证实在PH动物模型中发挥重要作用[2]。而硫化氢(H2S)是继一氧化氮及一氧化碳之后发现的第三种内源性气体信号分子，具有舒张血管、抑制血管平滑肌细胞增殖的作用[3],亦具有一定的抗炎作用[4]。本实验旨在通过野百合碱腹腔注射建立肺动脉高压大鼠模型，并预防性给予H2S干预，观察干预后肺动脉高压是否受到抑制，及干预后肺组织肥大细胞及血浆中IL-6的变化，为肺动脉高压提供新的治疗方向。

1 材料与方法

1.1 实验材料 成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠24只，体重160-220 g，周龄7周，购自沈阳军区总医院实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 按随机数字表法分为control组、MCT组及H2S组，每组8只。MCT组及H2S组：野百合碱60 mg/kg剂量一次性腹腔注射后饲养3周，control组注射等量的生理盐水，相同条件下饲养。H2S组大鼠于注射野百合碱的当天予以腹腔注射NaHS(56μmol/kg)，连续给予3周，MCT组和control组每天给予腹腔注射同等剂量的生理盐水，同等条件下饲养3周。

1.2.2 血流动力学指标检测 参照孙波[5]方法测定肺动脉平均压力(mPAP:mean pulmonary arterial press)。饲养3周后，大鼠称体重，10%水合氯醛 35 mg/kg腹腔注射麻醉后，仰卧位固定于小动物解剖台上。消毒颈部皮肤，作颈部正中偏右纵向切口2 cm，分离皮下，显露并游离右颈外静脉1 cm，在其下面穿入两根2/0手术丝线，远端结扎，近端活结准备，将微导管预充肝素生理盐水(防止管腔内存在气泡)后连接三通管再经换能器连接于BL-420S生物机能实验系统，调零，肝素盐水润管。于右颈外静脉近端作一斜切口，将微导管插入右颈外静脉中，将近端活结系紧以固定微导管，通过BL-420S生物机能实验系统测定并记录肺动脉平均压力。

1.2.3 右心室肥厚指数的检测 mPAP测定之后，正中开胸，完整切下大鼠心脏，沿房室沟剪除心房组织，分别剪取右心室(RV)和左心室+室间隔(LV+S)，用滤纸吸去血液后称重，计算RV/(LV+S) [右心室/(室间隔十左心室)]值,以此作为右心室肥大的指标。

1.2.4 组织固定及染色 自胸腔取出肺组织,分离后用10%中性甲醛经气管缓慢注入大鼠肺内,使肺平滑膨胀；同时经肺动脉用生理盐水灌洗肺，5分钟后将右下肺浸泡于10%中性甲醛中固定。1周后在左右肺的矢状切面各取组织两块,常规脱水,石蜡包埋，肥大细胞染色，测定各组大鼠肺组织甲苯胺蓝染色切片中肥大细胞数量及肺血管周围脱颗粒肥大细胞比例。

1.2.5 血浆内皮素IL-6检测(ELISA法) 大鼠处死前腹主动脉抽血离心保存，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法进行，严格按照试剂盒的说明步骤，检测大鼠血浆中IL-6的含量。

1.2.6 血浆H2S测定 采用去蛋白方法[6]，首先在玻璃试管中加入0.5 ml 10 g/L醋酸锌，然后加入0.1 ml血浆标本，振荡混匀，再依次加入20 mmol/L对苯二胺盐酸盐和30 mmol/L三氯化铁各0.5 ml，室温孵育20 min，再加入10%三氯醋酸1 ml使蛋白沉淀，加2.5 ml蒸馏水补足体积至5 ml，充分混匀，6 000 转/min离心5分钟，吸出上清液，用酶标仪在670 nm波长处测吸光度，依据H2S标准曲线计算血浆中H2S的含量。

2 结果

2.1 大鼠一般情况

3周后，对照组皮毛光泽，呼吸平稳，活动灵活，体重明显增加，无死亡；MCT组大鼠出现皮毛枯槁、松毛、无光泽，呼吸急促、肝肿大、活动减少、饮食减少等表现，死亡2只，死亡率为25%；而H2S组食欲可，体质量增加，呼吸平稳，活动良好，死亡1例，死亡率12.5%。

2.2 control组、MCT组及H2S组各指标检测比较

结果见表1。各组大鼠mPAP组间比较有统计学意义，P<0.05，与对照组相比，MCT组mPAP显著升高，差异显著(P<0．05)，H2S组大鼠mPAP较MCT组下降，差异显著(P<0．05)。大鼠右心肥厚指数组间比较有统计学意义(P<0.05)，MCT组右心肥厚指数显著高于对照组(P<0．05)，H2S组右心肥厚指数较MCT组降低，差异明显(P<0.05)。肥大细胞计数组间比较有统计学意义，P<0.05，与对照组大鼠相比，MCT组大鼠肺组织中肥大细胞计数均明显增高，差异显著(P<0.05)；与MCT组大鼠相比，H2S组大鼠肺内的肥大细胞计数明显减少，差异明显(P<0.05)。与对照组大鼠相比，MCT组大鼠肺组织中脱颗粒肥大细胞比例明显增高，差异显著(P<0.05)；与MCT组大鼠相比，H2S组大鼠肺内的脱颗粒肥大细胞的比例明显下降，差异显著(P<0.05)。大鼠血浆中IL-6平均浓度值组间比较有统计学意义，P<0.05。MCT组血浆中IL-6含量显著高于对照组(P<0．05)，H2S组大鼠血浆中IL-6含量较MCT组降低，差异显著(P<0．05)。血浆H2S含量组间比较有统计学意义，P<0.05。与对照组比较，MCT组大鼠血浆H2S含量降低，P<0.05；与MCT组比较，H2S组大鼠血浆H2S含量明显增高，P<0.05。

表 各组测量结果

注：mPAP:mean pulmonary arterial press,RV/LV+VS:right ventricle/left ventricle + septum。与对照组比较，*P<0.05，与MCT组比较，#P<0.05

3 讨论

肺动脉高压是一种累及肺动脉和右心的严重疾病，肺动脉压力持续上升为其基本特征，其发病原因尚未明确，它可以作为一种疾病独立存在，然而更多见的是多种心肺疾病进展到一定阶段的生理表现。PH发生和发展的病理生理基础是肺血管收缩、肺血管重构和肺血管原位血栓形成。野百合碱是一种生物碱，具有细胞毒性作用，经肝脏代谢后的产物——吡咯野百合碱可损伤肺动脉血管内皮细胞及肺毛细血管，使肺动脉血管重建、肺血管阻力增加，从而导致肺动脉高压[7]。实验结果显示MCT组大鼠mPAP、右心室肥厚指数与对照组相比差异显著(P<0.05),我们通过野百合碱(60 mg/kg)单次腹腔注射诱导肺动脉高压大鼠模型。

H2S是近年来发现的又一新的具有心血管调节功能的气体信号分子。有研究表明H2S具有扩张血管、降低血压的作用，能够促进血管平滑肌细胞的凋亡，并且抑制血管平滑肌细胞的增殖[8]，亦具有一定的抗炎作用。本实验预防性使用外源性H2S供体NaHS对肺高压大鼠进行干预，结果显示，MCT组应用NaHS干预后，血浆H2S的浓度明显升高，mPAP降低了24.98%，右心室肥厚指数下降了20.4%，表明H2S能够抑制PH的形成。

Miyata等[9]研究指出，在野百合碱所致的大鼠肺动脉高压模型的肺组织中可见到大量肥大细胞聚集的现象，肥大细胞的聚集对肺动脉高压的发生、发展起到了重要作用，而且多数肥大细胞以脱颗粒状态聚集在血管周边。Bhola K Dahal[10]等指出之所以肥大细胞在野百合碱所致的肺高压模型中出现大量聚集和脱颗粒现象，是由于野百合碱有很强的毒性作用，进而引起肺组织严重的炎症反应和肺血管的损伤，导致肺血管压力以及阻力的增加。本实验证实了Miyata和Dahal等人的研究，在野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠模型的肺组织切片中可以观测到大量的肥大细胞，结果显示，MCT组大鼠肺组织中肥大细胞数量明显增多，较对照组升高了79.21%(P<0.05)，其中脱颗粒肥大细胞比例较对照组升高了76.55%(P<0.05)。给予外源性硫化氢供体硫氢化钠对肺高压大鼠进行干预之后，大鼠血浆中H2S的浓度升高显著，肺组织中肥大细胞数量和脱颗粒肥大细胞的比例明显下降，说明了H2S对肥大细胞的聚集和脱颗粒有抑制作用。

肥大细胞被激活后能够产生IL-6、IL-13等炎症因子，这些介质在PH的发病机制和肺血管重构中发挥着重要的作用[11,12]。本实验检测了大鼠血浆中IL-6的含量，结果显示，MCT诱导的肺高压模型中血浆IL-6含量明显升高，H2S组大鼠炎症因子IL-6的表达较MCT组明显减少，说明硫化氢能够抑制IL-6的释放。提示H2S可能通过抑制肥大细胞的聚集、脱颗粒以及抑制IL-6的释放干预调节大鼠肺动脉高压的发生发展。

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Effects of hydrogen sulfide on mast cell and IL-6 in rats with pulmonary hypertension induced by monocrotaline

LIHong-yan,YINZong-tao,ZHAOKe-yan.

(DepartmentofCardiovascularSurgery,GeneralHospitalofShenyangMilitaryDistrict,Shenyang110840,China)

Objective To study the effects of H2S on mast cell and IL-6 in rats with pulmonary hypertension induced by monocrotaline.Methods A total of 24 male SD rats were randomly divided into 3 groups including MCT group,H2S group and control group(n=8 respectively).The rats of MCT group and H2S group were injected with a single intraperitoneal monocrotaline (60 mg/kg),and NaHS (56 μmol/kg) was injected into the rats in H2S group everyday,while the other groups saline was done instead.After 3 weeks,the mean pulmonary artery pressure(mPAP) and ratio of right ventricle/(left ventricle +septum) [RV/(LV+S)] of the rats in three groups were measured.The number of mast cell and degranulation was measured by toluidine blue stain.The plasma IL-6 level and the plasma H2S level of the rats were detected.Results After 3 weeks,compared with the control group,the MCT group showed increased mPAP and RV/(LV+S) (P<0.05);Both the number of mast cell and the ratio of degranulateted mast cell increased.The plasma IL-6 level also increased while the plasma H2S level was decreased.Compared with MCT group,both mPAP and RVHI were prevented in the H2S group.And also the number of mast cell decreased (n/10 mm2,12.14±3.72 vers 24.67±4.46，P<0.05),the ratio of degranulateted mast cell were decreased (29.31±6.71% vers 52.15±9.65%,P<0.05).In addition,H2S can lower plasma IL-6 level.Conclusion H2S probably can ameliorate PH by inhibiting accumulation and degranulation of mast cell and restraining the release of IL-6.

Hydrogen sulfide;Monocrotaline;Pulmonary hypertension;Mast cell;Interleukin-6

辽宁省自然科学基金(2015020421)；中国博士后科学基金(2013M542471)

1007-4287(2017)04-0689-04

R544.1+6

A

2016-08-06)

*通讯作者