TROP2、p-ERK1/2和Cyclin D1在胆囊癌组织中的表达及临床意义

李新星， 滕世峰， 徐 楷， 张言言， 张卫刚， 张宪文， 姚 骏， 姚厚山， 黄 歆， 胡志前

(第二军医大学附属长征医院 普外一科， 上海 200030)

TROP2、p-ERK1/2和Cyclin D1在胆囊癌组织中的表达及临床意义

李新星， 滕世峰， 徐 楷， 张言言， 张卫刚， 张宪文， 姚 骏， 姚厚山， 黄 歆， 胡志前

(第二军医大学附属长征医院 普外一科， 上海 200030)

目的 探讨胆囊癌组织中人滋养层细胞表面抗原(TROP)2、磷酸化细胞外信号调节激酶 (p-ERK)1/2和细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的表达及其与临床病理参数之间的关系，并分析其与胆囊癌患者预后的关系。方法 搜集第二军医大学附属长征医院2005年6月-2010年6月确诊并获取病理标本的胆囊癌患者88例，采用免疫组化法检测88例胆囊癌组织及15例癌旁组织中 TROP2、p-ERK1/2和Cyclin D1蛋白的表达。计数资料采用χ2检验，Spearman检验法分析TROP2、p-ERK1/2和Cyclin D1间相关性；单因素和多因素Cox回归分析胆囊癌患者预后的影响因素；Kaplan-Meier法绘制患者的生存曲线。结果 TROP2、p-ERK1/2和Cyclin D1蛋白在胆囊癌组织中的阳性表达率分别为74.30%、58.40%和55.30%，明显高于癌旁组织中的表达(5.42%、35.67%和39.87%)(P值均<0.05)。TROP2、p-ERK1/2和Cyclin D1蛋白的表达与胆囊结石、肿瘤直径、分化程度、血管神经侵犯、淋巴结转移、手术方式及TNM分期相关(χ2=4.300～53.315，P值均<0.05)。TROP2与p-ERK1/2、Cyclin D1的表达呈正相关(rs值分别为0.402、0.742，P值均<0.001)，且p-ERK1/2与Cyclin D1的表达也呈正相关(rs=0.242，P=0.023)。多因素生存分析提示，TROP2的阳性表达是患者3年生存率的独立危险因素(相对危险度=2.412，95%可信区间：1.186～5.126,P=0.010)。结论 TROP2的高表达可能是胆囊癌恶性进展的重要原因，高表达的TROP2可能介导p-ERK1/2和Cyclin D1的高表达，导致胆囊癌恶性进展。TROP2是判断胆囊癌患者预后的独立危险因素，有可能是临床干预的有效靶点。

胆囊肿瘤； 人滋养层细胞表面抗原2； 磷酸化细胞外信号调节激酶1/2； 细胞周期蛋白D1； 预后

胆囊癌是最常见的胆道系统肿瘤，其早期诊断困难，恶性程度高，预后差[1]。文献[2-3]报道，胆囊癌患者5年生存率不足5%，早期诊断困难及恶性进展是其生存期短的主要原因。目前，胆囊癌的主要治疗方式仍以手术为主，辅助放化疗，但治疗效果不理想。因此寻找胆囊癌发生发展的相关分子靶点，改善胆囊癌患者的预后是亟待解决的临床问题。

细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)是丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)通路的亚家族，磷酸化的ERK(phosphorylated extracellular signal regulated kinase，p-ERK)1/2是ERK的活化形式，可介导信号由胞浆向胞核传递，激活下游细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)等，参与肿瘤的增殖和转移。人滋养层细胞表面抗原(human trophoblast cell-surface antigen，TROP)2是一种单次跨膜表面糖蛋白，其名源于它在胚胎滋养层细胞和绒毛膜癌中的高表达，研究[4-6]证实TROP2在许多实体肿瘤中高表达，而在正常上皮或癌旁组织中低表达或不表达，参与多种肿瘤的恶性进展。文献[7]报道，在宫颈癌中TROP2通过ERK信号通路调节Cyclin D1蛋白的表达，进而促进宫颈癌细胞的增殖和转移。但在胆囊癌中未有研究报道。

因此，本研究通过检测 TROP2、p-ERK1/2和Cyclin D1蛋白在胆囊癌组织切片中的表达情况，并分析各种蛋白表达的关系及临床意义，探讨TROP2、p-ERK1/2和Cyclin D1在胆囊癌恶性进展中可能的作用机制，为临床靶向干预提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集本院2005年6月-2010年6月收治的胆囊癌患者，手术切除后病理证实为胆囊癌的肿瘤组织标本，所有患者均有完整的临床、病理及随访资料。入选标准：(1)经病理细胞学或组织学确诊的胆囊癌；(2)既往无第二或有第二肿瘤但已生存5年以上；(3)既往未行放化疗等新辅助治疗；(4)无活动性心脏病、无慢性活动性出血性疾病、近期无急性失血、无明显肾损伤、无血液系统疾病且造血功能正常；(5)2个月内无输血、未曾接受促红细胞治疗；(6)年龄≥18周岁；(7)有确切随访时间，且≥1个月。

1.2 免疫组化染色和判断标准

1.2.1 主要试剂和方法 山羊抗人TROP2单克隆抗体购自美国R&D公司，小鼠抗人p-ERK1/2和Cyclin D1单克隆抗体购自英国Abcam公司，DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。采用免疫组化三步法，按试剂盒说明进行操作，用PBS代替一抗作为阴性对照。用已知阳性的肿瘤标本作为阳性对照。

1.2.2 主要步骤 标本经10%甲醛溶液固定后石蜡包埋，制备厚度约4 μm厚的组织切片。二甲苯脱蜡15 min×3次，依次用90%、85%、75%、70%梯度的乙醇浸片，每次5 min；3%的H2O2/甲醇溶液浸泡10 min，以消除内源性过氧化物酶的影响，0.125%的EDTA胰蛋白酶抗修复液修复30 min，胎牛血清封闭30 min后，加一抗4 ℃孵育过夜。次日加标有生物素的二抗(兔抗小鼠/山羊)30 min，DAB显色后自来水充分冲洗，苏木素染色、脱水、透明、中性树胶封固。

1.2.3 结果判定 TROP2主要在细胞膜表达，部分在胞质表达，TROP2的蛋白表达评判主要依据Fong等[8]的标准，以染色比例和染色强度的乘积计算，总分为0～12分，其中≥4被认为是高表达。染色比例评分为：0，0分；<10%，1分；10%～50%，2分；51%～80%，3分；>80%，4分。染色强度评分为：无色0分,浅黄色1分,棕黄色2分,棕褐色3分。p-ERK1/2阳性表达为细胞核或细胞质出现黄色或棕黄色颗粒，Cyclin D1蛋白表达主要定位于胞核。选取10个高倍视野计数阳性细胞，按照Beeskey分级方法：以阳性细胞所占百分比并参考着色强度分级如下：无阳性细胞或阳性细胞数<10%为阴性，阳性细胞数≥10%为阳性。由病理科医师连续读片。其中临床参数淋巴结转移有无分期依据Shu等[9]文献报道，肿瘤直径3 cm为界点分组依据Liu等[10]文献报道。

1.3 随访 所有患者术后均进行定期随访，随访的内容为患者存活情况及生存质量，随访开始时间为患者接受手术的时间，截止日期为2014年12月31日，以患者死亡或末次随访日期为截点确定生存时间，随访时间中位数为36.75个月。采用门诊随访和电话随访相结合的方式，平均每3个月随访1次。

1.4 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析。计数资料采用χ2检验，相关性分析采用等级相关的Spearman法检验。单因素和多因素Cox回归分析胆囊癌患者预后的影响因素；Kaplan-Meier法绘制患者的生存曲线。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 共收集肿瘤组织标本88例，其中R0根治性手术切除72例，R1姑息性手术切除16例。收集胆囊癌旁新鲜组织共15例。88例患者中，男21例，女67例，平均60.28岁，伴结石者39例。肿瘤高分化24例，中分化30例，低分化34例。依据美国癌症联合研究会(ATCC)分期标准，Ⅰ/Ⅱ期52例，Ⅲ/Ⅳ期36例，伴有血管神经侵犯34例。手术患者均恢复良好，出院后有无继续选择放化疗、免疫治疗、靶向治疗等信息未予以采集。

2.2 TROP2、p-ERK1/2和Cyclin D1蛋白在胆囊癌及癌旁组织中的表达情况 TROP2蛋白主要定位于细胞膜，随着分化程度的降低，部分表达于胞质，p-ERK1/2阳性表达为细胞核或细胞质出现黄色或棕黄色颗粒，Cyclin D1蛋白表达主要定位于胞核(图1)。TROP2、p-ERK1/2和Cyclin D1蛋白在胆囊癌组织中的阳性表达率分别为74.30%、58.40%和55.30%，与癌旁组织中的表达比较(5.42%、35.67%和39.87%)，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。

2.3 TROP2、p-ERK1/2和Cyclin D1蛋白的表达与胆囊癌临床病理特征的关系 TROP2、p-ERK1/2和Cyclin D1蛋白的表达与胆囊癌患者的性别、年龄均无关(P值均>0.05)。伴有胆囊结石、肿瘤直径≥3 cm或有血管神经侵犯患者的癌组织中3种蛋白的表达，与无胆囊结石、肿瘤直径<3 cm或无血管神经侵犯患者相比，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。R1姑息性手术组与R0根治性手术组比较，胆囊癌组织中3种蛋白的表达差异有统计学意义(P<0.05)。分化程度低、存在淋巴结转移或TNM Ⅲ/Ⅳ期患者的癌组织中3种蛋白的表达，与高/中分化、无淋巴结转移或TNM I/Ⅱ期患者相比，差异均有统计学意义(P值均<0.05)(表1)。

2.4 胆囊癌组织中TROP2、p-ERK1/2和Cyclin D1蛋白表达的相关性分析 TROP2与p-ERK1/2、Cyclin D1的表达呈正相关(rs值分别为0.402、0.742，P值均<0.001)，且p-ERK1/2与Cyclin D1的表达也呈正相关(rs=0.242，P=0.023)。

2.5 单因素和多因素分析胆囊癌患者生存预后的影响因素 单因素生存分析显示，TROP2、p-ERK1/2和Cyclin D1蛋白的表达影响胆囊癌患者的3年生存率(P值均<0.05)；多因素Cox回归分析显示，TROP2阳性表达是胆囊癌患者预后的独立危险因素(P<0.05)(表2，图2)。

表1 TROP2、p-ERK1/2和Cyclin D1与临床病理参数的关系(例)

表2 单因素和多因素分析胆囊癌患者3年生存率的影响因素

图2 高表达TROP2患者的K-M生存曲线

3 讨论

TROP2是上皮细胞膜表面糖蛋白受体，作为细胞内钙信号的跨膜转导子，TROP2在正常组织中无表达或表达很低，而在许多恶性肿瘤癌中高表达，例如胃癌[11]、胰腺癌[8]、肺癌[12]等。Fong等[13]发现，在口腔癌组织中TROP2的表达与组织分化、浸润深度等密切相关，且随着TROP2表达升高，总体存活率下降。TROP2在咽喉鳞状上皮细胞癌组织中的表达与组织分化程度和淋巴结转移相关，TROP2是咽喉癌患者生存预后的独立预测因子[14]。Chen等[6]也报道，TROP2表达与部分胆囊癌临床参数相关。但与其报道不同的是，在纳入胆囊结石、肿瘤直径两个因素后，笔者发现伴有胆囊结石、肿瘤直径≥3 cm的患者TROP2的表达更高，且具有更差的预后[15]。这可能是因为胆囊结石作为一种长期刺激因素，造成胆囊内膜的炎症反应，导致内膜细胞异常增殖、发生癌变甚至促进转移浸润。而肿瘤直径≥3 cm具有更强的浸润能力，促进癌症进展。此外，笔者也进一步证实，淋巴结转移、TNM分期和TROP2表达是胆囊癌患者预后的独立危险因素，或许靶向干预TROP2可成为临床上治疗肿瘤的一种方式。

迄今，对于TROP2参与胆囊癌恶性进展可能的机制未见报道。有研究[16]结果显示，TROP2的表达上调激活Cyclin D1和ERK/MEK通路从而增强CREBI、e-Jun、NF-KB、Rb、STATl和STA33的表达，提示TROP2可能通过激活下游信号通路，导致肿瘤的恶性增殖和转移，是癌症患者生存期短的重要原因。Cyclin D1已被报道与胆囊癌细胞周期增殖相关，但p-ERK1/2在胆囊癌中的表达未见报道[17-18]。本研究发现，p-ERK1/2蛋白在胆囊癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁组织，且伴有胆囊结石、肿瘤直径≥3 cm或有血管神经侵犯患者的胆囊癌组织中p-ERK1/2蛋白的表达更高。随着分化程度越低、淋巴结转移或TNM分期越高，p-ERK1/2蛋白的表达均更高。笔者还发现，TROP2与p-ERK1/2、Cyclin D1的表达呈正相关，且p-ERK1/2与Cyclin D1也呈正相关。生存分析显示，胆囊癌患者的3年生存率与TROP2、p-ERK1/2和Cyclin D1蛋白的表达均相关，提示高表达的TROP2可能介导p-ERK1/2和Cyclin D1的高表达，导致胆囊癌恶性进展，影响生存率。这为进一步从细胞和动物模型水平深入研究其可能的机制提供了理论依据，也是笔者进一步需要探讨的课题。

本研究尚存在几点不足：(1)本研究缺乏胆囊癌患者术后化疗、免疫治疗、靶向治疗等信息，而这些信息可能影响胆囊癌患者的生存；(2)本研究未纳入其他病理类型的胆囊癌组织，如鳞癌、鳞腺癌、未分化癌等，不同类型来源的胆囊癌患者的生存情况是不一样的；(3)本研究不是大数据、多中心研究来源组织，结果需要进一步验证，甚至需要机制实验进一步探索。

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引证本文：LI XX, TENG SF, XU K, et al. Expression of trophoblast cell-surface antigen 2, phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2, and cyclin D1 in gallbladder carcinoma tissue and related clinical significance[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(5): 909-914. (in Chinese) 李新星， 滕世峰， 徐楷， 等. TROP2、p-ERK1/2和Cyclin D1在胆囊癌组织中的表达及临床意义[J]. 临床肝胆病杂志, 2017, 33(5): 909-914.

(本文编辑：朱 晶)

Expression of trophoblast cell-surface antigen 2, phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2, and cyclin D1 in gallbladder carcinoma tissue and related clinical significance

LIXinxing,TENGShifeng,XUKai,etal.

(FirstDepartmentofGeneralSurgery,ChangzhengHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200030,China)

Objective To investigate the expression of human trophoblast cell-surface antigen 2 (TROP2), phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2 (p-ERK1/2), and cyclin D1 in gallbladder carcinoma tissue and their correlation with clinicopathological parameters, as well as their association with the prognosis of patients with gallbladder carcinoma. Methods A total of 88 patients who were diagnosed with gallbladder carcinoma in Changzheng Hospital, Second Military Medical University, from June 2005 to June 2010 were enrolled, and their pathological specimens were obtained. Immunohistochemistry was used to measure the expression of TROP2, p-ERK1/2, and cyclin D1 in 88 gallbladder carcinoma tissue samples and 15 adjacent tissue samples. The chi-square test was used for comparison of categorical data between groups, and the Spearman method was used to investigate the correlation between any two parameters of TROP2, p-ERK1/2, and cyclin D1; univariate and multivariate Cox regression analyses were used to analyze the influencing factors for the prognosis of patients with gallbladder carcinoma; the Kaplan-Meier method was used to plot their survival curves. Results The positive rates of TROP2, p-ERK1/2, and cyclin D1 in gallbladder cancer tissue were 74.30%, 58.40%, and 55.30%, respectively, significantly higher than those in adjacent tissue (5.42%, 35.67% and 39.87%, respectively) (P<0.05). The expression of TROP2, p-ERK1/2, and cyclin D1 was associated with gallstones, tumor diameter, degree of tumor differentiation, vascular and perineural invasion, lymph node metastasis, surgical procedure, and TNM stage (χ2=4.300～53.315, allP<0.05). The expression of TROP2 was positively correlated with that of p-ERK1/2 and cyclin D1 (rs=0.402 and 0.742, bothP<0.001), and the expression of p-ERK1/2 was also positively correlated with that of cyclin D1 (rs=0.242,P=0.023). The multivariate survival analysis showed that positive expression of TROP2 had a significant influence on 3-year survival rate (RR=2.412,95%CI:1.186～5.126,P=0.010). Conclusion High expression of TROP2 may be an important reason for malignant progression of gallbladder carcinoma, and highly expressed TROP2 may mediate the high expression of p-ERK1/2 and cyclin D1, resulting in the malignant progression of gallbladder carcinoma. Positive expression of TROP2 is an independent risk factor for the prognosis of patients with gallbladder carcinoma and may be an effective target for clinical intervention.

gallbladder neoplasms；human trophoblast cell-surface antigen 2；phosphorylated extracellular signal regulated kinase 1/2；cyclin D1；prognosis

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.05.024

2016-11-03；

2017-01-08。

国家青年科学基金资助(8140101730)

李新星(1986-)，男，主治医师，主要研究肝胆胰肿瘤的发生机制。

胡志前，电子信箱：huzhiq163@163.com。

R735.8

A

1001-5256(2017)05-0909-06