非小细胞肺癌中间质细胞衍生因子—1及神经生长因子的表达及其临床意义

杨庆珣+梁有卓

【摘要】 目的：探討间质细胞衍生因子-1（SDF-1）与神经生长因子（NGF）在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达及临床意义。方法：收集2014年2月-2016年5月本院胸外科手术切除的人NSCLC病理标本65例作为观察组，其中观察组按不同病理级别分为了Ⅰ级15例为Ⅰ组，Ⅱ级24例为Ⅱ组，Ⅲ级26例为Ⅲ组。同时随机选择健康者正常肺组织标本64例为对照组，各组组织均使用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）技术检测SDF-1与NGF mRNA，同时采用免疫组化法检测各组组织中SDF-1与NGF蛋白的表达情况。并分析比较各组组织中SDF-1与NGF mRNA及蛋白表达情况。结果：观察组SDF-1与NGF mRNA基因表达量及蛋白阳性率均高于对照组（P<0.05）；Ⅲ组SDF-1与NGF mRNA基因表达量及蛋白阳性率均高于Ⅱ组（P<0.05）；Ⅱ组SDF-1与NGF mRNA基因表达量及蛋白阳性率均高于Ⅰ组（P<0.05）；NSCLC组织中SDF-1与NGF mRNA基因表达量及蛋白阳性率随病理级别的增高而增高（P<0.05）。SDF-1和NGF高表达均是预测NSCLC预后不良的独立因素（P<0.01），SDF-1和NGF的高表达与NSCLC患者整体不良预后显著相关（P<0.01）。结论：NSCLC中SDF-1与NGF高表达对病变进展有一定促进作用，两者与肿瘤的病理级别密切相关，SDF-1与NGF在NSCLC的发生发展中扮演重要的角色，有望为NSCLC的临床检测及治疗提供新思路。

【关键词】 非小细胞肺癌； 间质细胞衍生因子-1； 神经生长因子； 实时荧光定量聚合酶链式反应； 免疫组化

Expression and Clinical Significance of Stromal Cell Derived Factor-1 and Nerve Growth Factor in Non-small Cell Lung Cancer/YANG Qing-xun，LIANG You-zhuo.//Medical Innovation of China，2017，14（09）：033-036

【Abstract】 Objective：To investigate the expression and clinical significance of stromal cell derived factor-1（SDF-1） and nerve growth factor（NGF） in non-small cell lung cancer（NSCLC）.Method：65 NSCLC patients who underwent surgical resection in our hospital from February 2014 to May 2016 were selected as observation group，the observation group was divided into different groups according to different pathological grades， 15 cases in grade Ⅰ as the group Ⅰ，24 cases in grade Ⅱ as the group Ⅱ，26 cases in grade Ⅲ as the group Ⅲ.At the same time，randomly selected healthy subjects of normal lung tissue specimens of 64 cases for the control group.All groups were used real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction （RT-PCR） technique to detect SDF-1 and NGF expression of mRNA，and immunohistochemical detected SDF-1 and NGF protein in tissue，and tissues were analyzed and compared with NGF SDF-1 mRNA and protein expression.Result：The SDF-1 and NGF mRNA gene expression and protein positive rates in observation group were significantly higher than those in control group（P<0.05）；the SDF-1 and NGF mRNA gene expression and protein positive rates in group Ⅲ were higher than those of group Ⅱ（P<0.05）；the SDF-1 and NGF mRNA gene expression and protein positive rates in group Ⅱ were higher than those of group Ⅰ（P<0.05）；the expression of SDF-1 and NGF in NSCLC tissues and the positive rate of mRNA increased with the increase of pathological grade（P<0.05）.The high expression of SDF-1 and NGF were independent predictors of poor prognosis of NSCLC （P<0.01），and the high expression of SDF-1 and NGF were significantly correlated with the poor prognosis of patients with NSCLC（P<0.01）.Conclusion：The high expression of SDF-1 and NGF in NSCLC may promote the progression of the disease，both are closely related to the pathological grade of the tumor，SDF-1 and NGF play an important role in the occurrence and development of NSCLC，which is expected to provide new ideas for clinical detection and treatment of NSCLC.

【Key words】 Non-small cell lung cancer； Stromal cell derived factor-1； Nerve growth factor； Real-time quantitative polymerase chain reaction； Immunohistochemistry

First-authors address：The Central Hospital in Baoan District of Shenzhen，Shenzhen 518102，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.09.010

非小細胞肺癌（NSCLC）是最常见的原发性恶性肿瘤之一[1]，NSCLC的生长方式为浸润性生长，药物化疗治疗与手术治疗均预后差，复发率及致死率均很高[2-3]。NSCLC发病原因尚不明确，其病变进展中出现多种蛋白表达失调[4]；间质细胞衍生因子-1（SDF-1）、神经生长因子（NGF）基因及其蛋白表达是近年来肿瘤学领域的研究热点之一，文献[5]研究认为，SDF-1与NGF与多种恶性肿瘤的预后特别是肿瘤的转移有关。笔者通过实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）定量与免疫组化定性技术，以探讨SDF-1与NGF基因及其蛋白表达水平与NSCLC的恶性程度的关系及临床诊断价值，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年2月-2016年5月本院胸外科手术的人NSCLC病理标本65例作为观察组，男38例，女27例，年龄47～78岁，平均（55.6±12.2）岁，患者术前未接受放化疗等治疗，均无其他肿瘤病史，均排除肝、肾、心脏和血液性疾病，患者均有齐全完整的临床资料。所有病理标本均取出一部分制作成石蜡切片，通过HE染色后，由病理科组织两位经验丰富病理医生进行双盲镜检读片，其中肺鳞癌28例为鳞癌组，肺腺癌25例为腺癌组，其他型肺癌12例为其他组；淋巴结转移35例为转移组，无淋巴结转移者30例为无转移组，TNM分期按照国际肺癌研究会（IASLC）公布的标准[6]，其中Ⅰ级15例为Ⅰ组，Ⅱ级24例为Ⅱ组，Ⅲ级26例为Ⅲ组。同时随机选择健康者肺组织标本64例为对照组，男32例，女32例，年龄46～78岁，平均（56.2±11.9）岁。观察组与对照组的年龄和性别比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。患者家属均知情，依从性良好并签署知情同意书。

1.2 方法 观察组患者组织标本为进行外科手术所切取的NSCLC标本，对照组的组织标本为健康者肺组织标本。两组均在术中各取两组份标本，其中一份标本通过甲醛固处理备用，另外一份标本通过液氮固定处理备用。

1.2.1 免疫组化法检测 SDF-1和NGF表达检测：SDF-1和NGF表达的检测采用采用免疫组化SP法，步骤均严格按照试剂盒的说明书进行操作。结果判定标准：所有的免疫组化SP切片均由两位病理学主治医师以上的医师对的染色结果进行评定，在高倍镜下（400倍）随机抽取5个视野，判断标准参照隋锐等[7]的计数方法计算阳性细胞率，阴性：比率<5%；弱阳性：比率5%～25%；阳性：比率25%～50%；强阳性>50%。总阳性率=弱阳性率+阳性率+强阳性率。

1.2.2 RT-PCR定量检测 PCR引物序列：参照Kenri等[8]的方法设计正反及探针义链，内参基因为甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）均由FAM标记，由广州中山大学达安基因有限公司合成，见表1，与设计的目的片段大小一致。各组份的检测所需的标本均采用液氮固定处理的标本，并按照试剂盒说明进行SDF-1与NGF的RNA萃取，RT-PCR方法获得cDNA片段，基因分析采用美国MJR Option。（2）实时荧光FQ-PCR分仪自带的基因分析应用软件及Gen Bank对比分析基因序列同源性，RNA表达量与内参基因的比值表示 mRNA的相对表达量。

1.3 统计学处理 数据采用SPSS 18.0 for Windows软件进行数据分析，风险级别采用Cox回归模型，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间计量资料比较采用t检验，多组计量资料比较采用F检验；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者SDF-1与NGF mRNA基因表达量及蛋白阳性率比较 观察组SDF-1与NGF mRNA基因表达量及蛋白阳性率均高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.2 NSCLC各组mRNA基因表达量及蛋白阳性率比较 Ⅲ组SDF-1与NGF mRNA基因表达量及蛋白阳性率均高于Ⅱ组（P<0.05）；Ⅱ组SDF-1与NGF mRNA基因表达量及蛋白阳性率均高于Ⅰ组（P<0.05），NSCLC组织中SDF-1与NGF mRNA基因表达量及蛋白阳性率随病理级别的增高而增高（P<0.05），见表3。

2.3 SDF-1和NGF预后相关性分析 SDF-1和NGF高表达均是预测NSCLC预后不良的独立因素（P<0.01），见表4。SDF-1和NGF的高表达与NSCLC患者整体不良预后显著相关（P<0.01），见表5。

3 讨论

NSCLC占恶性肺癌发病率的首位[9]，NSCLC发病比较隐匿性，其确诊时大多已是中晚期肺癌，因此，容易错过了NSCL最佳治疗时机，严重影响NSCL治疗效果[10]。目前，对NSCLC诊断及病情变化的判断主要依靠主要依赖影像学检查及术后病理诊断，缺乏具有指导意义的肿瘤标记物[11]，尽管近年来报到了许多与NSCLC相关的蛋白及因子，但关于这些蛋白对NSCLC诊断及预后的提示作用至今尚未达成共识[12-13]。

本研究结果表明，SDF-1和NGF在NSCLC中的表达均明显高于正常肺组织中的表达，NGF与SDF-1的表达从对照组到NSCLC的Ⅰ级组、Ⅱ级组、Ⅲ级组逐渐增高，且差异均有统计学意义（P<0.05）；SDF-1是来源于上皮细胞和间皮细胞所分泌的具有特殊化学诱导作用的生物因子，是属于趋化因子家族成员之一，参与肿瘤细胞趋化性、血管生成及肿瘤转移的功能，文献[14]研究表明，SDF-1在多种肿瘤中均有表达，参与了肿瘤细胞的侵袭和转移。SDF-1在正常的肺组织中，维持较低的生物水平，不发挥迁移及趋化的作用，当肺组织发生低氧、缺血和炎症等病变后，SDF-1高度表达，趋化免疫系统的单核细胞—巨噬细胞向受损肺组织迁移并发挥相应的免疫生物学效应[15-16]，SDF-1能够激活机体的ERK-1/2和Akt信号通路，募集内皮前祖细胞诱导肿瘤血管生成，调节抗凋亡信号途径促进细胞增殖，直接作用肿瘤细胞促进肿瘤的生长[17]。NGF是神经系统重要的营养因子之一，NGF具有多功能性生长因子，对免疫和炎症细胞具有确切的趋化和增殖活性，夏玉等[18]研究表明，NGF是—种在神经-免调节环路中起作用的因子，NGF在NSCLC的发生和增殖过程中起非常重要的作用，促进肿瘤血管的修复或重新形成新的肿瘤血管，有助于肿瘤细胞趋化性及肿瘤转移[19]。NSCLC癌组织中NGF与SDF-1表达水平相关性分析结果表明，SDF-1和NGF的表达与NSCLC患者整体不良预后密切相关，NGF与SDF-1间的相互作用是影响NSCLC癌细胞生长的重要因素，NGF与SDF-1共同参与了NSCLC的发生、发展、转移及浸润，NSCLC癌细胞是一个复杂的细胞学和生物化学对损伤与再生的反应性调控过程[20]，当损伤刺激后NGF与SDF-1即逆转为高表达状态。

本试验的结果可以看出NGF与SDF-1在NSCLC中的表达风险级别回归分析，NGF与SDF-1的表达水平与患者的年龄、性别和肿瘤的大小无明显关系，而与NSCLC的分化程度有密切关系，提示NGF与SDF-1的高表达是NSCLC发生的重要的危险因素之一，NGF与SDF-1在促进胶质肿瘤的发生、发展、转移及浸润中可发挥重要作用。

综上所述，NSCLC中SDF-1与NGF高表达对病变进展有一定促进作用，两者与肿瘤的病理级别密切相关，两者相互作用，SDF-1与NGF在NSCLC的发生发展中扮演重要的角色，有望为NSCLC的临床检测及治疗提供新思路。

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