不同反应温度下T1脂肪酶催化油酸与甘油酯化反应动力学研究

覃小丽, 王永华,钟金锋

(1.西南大学食品科学学院，重庆 400715； 2. 华南理工大学食品科学与工程学院， 广州 510640)

油脂化学

不同反应温度下T1脂肪酶催化油酸与甘油酯化反应动力学研究

覃小丽1, 王永华2,钟金锋1

(1.西南大学食品科学学院，重庆 400715； 2. 华南理工大学食品科学与工程学院， 广州 510640)

T1脂肪酶是一种新型耐热脂肪酶，能催化油酸与甘油的酯化反应。当甘油与油酸物质的量比2∶1、酶的添加量9.7 U/g(占总反应物质量)、缓冲液的添加量5%(占总反应物质量)和转速542 r/min时，考察不同反应温度(40、50、60℃)下T1脂肪酶催化油酸与甘油酯化反应的动力学。结果表明，T1脂肪酶催化该酯化反应活化能为20.272 9 kJ/mol；当反应温度较低(40℃)时遵循准一级反应；随着反应温度升高到较高范围(50、60℃)，则变为准二级反应。

T1 脂肪酶；甘油；油酸；酯化反应；动力学

T1脂肪酶来源于Geobacillussp.，是一种新型脂肪酶，在较高的反应温度(60℃)下仍保持较高的酶活性和广泛的底物特异性与选择性[1-2]。近年来，对T1脂肪酶的研究主要集中在表达、分离纯化和酶学性质[2-5]等方面，而对T1脂肪酶应用于油脂改性的研究相对较少[6-8]。前期研究[6]显示，尽管T1脂肪酶对长链脂肪酸(硬脂酸、油酸)的选择性较差，但是其催化油酸与甘油的酯化反应在2 h内达到80%左右的酯化率，显示了其作为生物催化剂在油脂领域具有潜在应用。此外，我们前期从各反应因素(水添加量、反应温度、甘油和油酸物质的量比)对酯化率的影响出发，假设其遵循改进的一级反应动力学，结果表明模型计算值与实验值呈现较好的线性关系(R2=0.996)[9]。但是，该研究仅讨论了各反应因素对半经验的动力学方程系数的影响，对反应温度与从反应机理推导的动力学方程的关系还缺乏深入研究，尤其是T1脂肪酶催化甘油与油酸酯化过程的动力学及其活化能尚未见报道，不利于后续工艺的优化。因此，本文将进一步探索反应温度对T1脂肪酶催化油酸与甘油的酯化反应的影响，从反应机理角度研究T1脂肪酶催化油酸与甘油酯化反应的动力学并建立动力学模型，以期为T1脂肪酶应用于油脂改性工艺设计提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

甘油酯标准品(单油酸甘油酯、二油酸甘油酯、三油酸甘油酯)， Sigma-Aldrich公司；油酸(>70%，分析纯)，上海精纯试剂有限公司；T1脂肪酶(粗酶，含纤维素结合域)， 实验室自制[6]；甘油、正己烷和异丙醇为色谱纯，天津科密欧药品公司。

1.1.2 仪器与设备

DF-101S集热式磁力搅拌器，河南省予华仪器有限公司；Waters 1525型高效液相色谱仪、Waters 2414型示差折光检测器，Waters公司。

1.2 实验方法

1.2.1 T1脂肪酶催化酯化反应

将甘油与油酸(物质的量比2∶1，油酸4.3 g)添加到25 mL具塞锥形瓶中，随后加入占总反应物质量5%的缓冲液(0.05 mol/L Tris-HCl, pH 9.0)，充分混匀后在反应温度下预热后加入9.7 U/g 的T1脂肪酶，置于一定温度的磁力搅拌器(转速542 r/min)中反应。考察反应温度(40～70℃)对酶促酯化反应的影响。在反应过程中定时(0、1、2、3、6、9、12 h)取样，样品经离心(6 950×g，10 min)后，上层(油相)用于HPLC分析。实验结果以2次测定结果的算术平均值表示。

1.2.2 酯化产物的HPLC分析

样品处理：取20 μL油相(见1.2.1)于1.5 mL色谱瓶中，用1 mL流动相溶解并充分混匀，待HPLC分析。

HPLC对产物分析的主要条件：Phenomenex Luna Silica色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温35℃；流动相为正己烷-异丙醇-甲酸(体积比15∶1∶0.003)；流速1.0 mL/min；进样量10 μL。通过对比标准样品的保留时间对酶促酯化反应中各组分进行定性；各出峰组分(油酸、单油酸甘油酯、二油酸甘油酯、三油酸甘油酯)相对含量通过面积归一化法进行定量。油酸酯化率(FA)按公式(1)计算：

(1)

式中：F0为反应初始时油酸的相对含量，%；Ft为反应一段时间后混合物中油酸的相对含量，%。

1.2.3 数据统计分析

采用MicrosoftExcel2010对油酸与甘油在T1脂肪酶作用下的酯化率数据进行处理；以油酸的酯化率为指标进行反应过程分析，采用最小二乘法(Solver,MicrosoftExcel2010)进行拟合得到酯化反应动力学方程模型的参数。

2 结果与讨论

2.1 动力学模型的建立

在T1脂肪酶的催化作用下，油酸与甘油的酯化反应可由下面的反应式表述。该酯化反应的反应速率可由公式(2)表示。

(2)

式中：rA为油酸的反应速率；ke为酯化反应的速率常数；CA为反应物油酸(A)的浓度；CB为反应物甘油(B)的浓度；α、β为反应级数。

(3)

假设在油酸与甘油酯化反应过程中油酸的酯化率为FA，反应体系中油酸的初始浓度为CA0，则在反应的任意时刻，油酸的浓度(CA)可用公式(4)表示。

(4)

(5)

公式(4)与公式(5)合并得到

(6)

(7)

2.2 T1脂肪酶催化油酸与甘油的酯化反应动力学方程参数的确定

图1为不同反应温度下油酸酯化率与反应时间的关系。从图1中可看出，在甘油与油酸物质的量比2∶1、酶的添加量9.7 U/g(占总反应物质量)、缓冲液的添加量5%(占总反应物质量)和转速542 r/min 情况下，油酸酯化率随着反应温度的升高而呈现先增大后减少的趋势。当反应温度为60℃时，在考察的反应时间范围内油酸酯化率最高；而当反应温度继续升高到70℃时，油酸酯化率急剧降低，酯化率小于11.5%，这主要由于T1脂肪酶在此反应温度下蛋白质发生变性，酶活力严重损失。因此，不考虑反应温度在70℃时对该酯化反应动力学参数的影响。

图1 反应温度对酯化反应的影响

在反应温度40～60℃范围内，油酸酯化率与反应时间呈现一定的非线性关系[9](见图1)。以Origin 8.0软件作图(反应时间t为横坐标，油酸酯化率FA为纵坐标)，选用非线性方程(FA=a0-a1e-a2t)对数据进行拟合，得到该方程的各个系数(a0、a1、a2)，结果见表1。由表1可知，相关系数R2均在0.95以上，说明该非线性方程能较好表述不同反应温度下油酸酯化率与反应时间的关系。

表1 不同反应温度下油酸酯化率与反应时间拟合结果

(8)

根据拟合方程可以得到在不同反应温度的参数，结果见表2。

表2 不同温度下的反应级数和反应速率常数

由表2可知，该酯化反应在较低温度(40℃)时呈现准一级反应；在较高温度(50、60℃)时则呈现准二级反应。

2.3 T1脂肪酶催化油酸与甘油酯化反应的活化能

(9)

图2 lnk与1/T的关系

3 结 论

[1] LEOW T C, RAHMAN R N Z R A, BASRI M, et al. A thermoalkaliphilic lipase ofGeobacillussp. T1 [J]. Extremophiles, 2007, 11(3): 527-535.

[2] LEOW T C, RAHMAN R N Z R A, BASRI M, et al. High level expression of thermostable lipase fromGeobacillussp. strain T1 [J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2004, 68(1): 96-103.

[3] RAHMAN R N Z R A, LEOW T C, BASRI M, et al. Secretory expression of thermostable T1 lipase through bacteriocin release protein [J]. Protein Expr Purif, 2005, 40(2): 411-416.

[4] WANG Y, WEI D Q, WANG J F. Molecular dynamics studies on T1 lipase: insight into a double-flap mechanism [J]. J Chem Inf Model, 2010, 50(5): 875-878.

[5] HAGIWARA Y, MATSUMURA H, TATENO M. Functional roles of a structural element involving Na+-π interactions in the catalytic site of T1 lipase revealed by molecular dynamics simulations [J]. J Am Oil Chem Soc, 2009, 131(46): 16697-16705.

[6] QIN X L, LAN D M, ZHONG J F, et al. Fatty acid specificity of T1 lipase and its potential in acylglycerol synthesis [J]. J Sci Food Agric, 2014, 94(8): 1614-1621.

[7] QIN X L, HUANG H H, LAN D M, et al. Typoselectivity of crudeGeobacillussp. T1 lipase fused with a cellulose-binding domain and its use in the synthesis of structured lipids [J]. J Am Oil Chem Soc, 2014, 91(1): 55-62.

[8] XU Y, GUO S H, WANG W F, et al. Enzymatic hydrolysis of palm stearin to produce diacylglycerol with a highly thermostable lipase [J]. Eur J Lipid Sci Technol, 2013, 115(5): 564-570.

[9] 钟金锋, 覃小丽, 王永华. T1 脂肪酶催化合成甘油酯过程酯化率变化规律研究 [J]. 中国粮油学报, 2014, 29(12): 60-64.

Kinetics on T1 lipase-catalyzed esterification of oleic acid and glycerol at different temperatures

QIN Xiaoli1,WANG Yonghua2, ZHONG Jinfeng1

(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. School of Food Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

T1 lipase was a kind new thermostable lipase and it could catalyze esterification of oleic acid and glycerol. Under the conditions of molar ratio of glycerol to oleic acid 2∶1, dosage of enzyme 9.7 U/g(based on total mass of reactants) , dosage of Tris-HCl buffer 5%(based on total mass of reactants) and stirring speed 542 r/min, the kinetics of esterification of oleic acid and glycerol catalyzed with T1 lipase at different temperatures were inveastigated. The results showed that the activation energy was 20.272 9 kJ/mol. The kinetic model was pseudo-first order reaction when reaction temperature was lower (40℃), but it became pseudo-second order reaction when the reaction temperature increased to 50℃ and 60℃.

T1 lipase; glycerol; oleic acid; esterification; kinetics

2016-07-21；

2016-11-30

重庆市基础科学与前沿技术研究专项(cstc2015jcyjA80013)；国家自然科学基金(31501446；31601430)；中国博士后科学基金(2016M602636)；中央高校基本科研业务费专项(XDJK2016B034)

覃小丽(1984)，女，讲师，博士，研究方向为油脂的生物酶法改性(E-mail)qinxl@swu.edu.cn。

钟金锋，副教授，博士(E-mail)jinfzhong@163.com。

TQ641;Q555

A

1003-7969(2017)02-0034-04