四川麸醋醋醅中产酸细菌的分离及产酸特性研究

于华，黄丹*，欧俊模，陈卓，唐姣

(1.四川理工学院 生物工程学院，四川 自贡 643000；2.泸州护国陈醋股份有限公司，四川 泸州 646318)

四川麸醋醋醅中产酸细菌的分离及产酸特性研究

于华1，黄丹1*，欧俊模2，陈卓1，唐姣1

(1.四川理工学院 生物工程学院，四川 自贡 643000；2.泸州护国陈醋股份有限公司，四川 泸州 646318)

以四川麸醋为研究对象，从醋醅中筛选出一株产酸能力强的优势菌株，并对其产酸特性进行探索。采用平板涂布划线和平皿生化反应等传统分离方法对四川麸醋醋醅中的产酸细菌进行分离，通过测定产酸能力进行复筛，运用形态学特征和遗传学特征对分离菌株进行鉴定，并通过单因素试验和正交试验研究分离菌株最适产酸条件，采用高效液相色谱技术对分离菌株发酵液中的有机酸成分进行分析。结果表明：筛选出的产酸能力较强的菌株为产酸芽孢杆菌(Bacillusacidiproducens)，其最适产酸条件是在培养时间为24 h，培养温度为45 ℃，培养基初始pH为4.5时，产酸能力达到0.6105 g/dL。在发酵液中检测出3种有机酸成分，分别为酒石酸、甲酸和柠檬酸，其含量分别为0.270，1.658，2.284 mg/mL。

麸醋；产酸细菌；分子生物学鉴定；产酸特性

食醋是我国饮食生活中必不可少的一种酸性调味品，在我国有着非常悠久的历史，其酿造工艺是我国古代劳动人民智慧的结晶，它的发明、发展和传播是对人类饮食文化的一大贡献。传统酿造食醋的味感主要由有机酸、糖分及氨基酸等组分所决定。而其中有机酸是主要的风味物质，其形成主要有两种途径：一是在酒精发酵和醋酸发酵过程中由多种微生物的代谢而产生，并中发酵过程中相互转化；二是在食醋煎煮及陈放过程的化学反应而产生。另外还有一些是由其原料带入，并在发酵过程中慢慢消耗，或成为其他代谢物合成的前体物质。随着食醋发酵的进行，最后形成了食醋典型的酸味[1]。食醋中的有机酸可分为挥发性酸和不挥发性酸，挥发性酸以乙酸为主，不挥发性酸以乳酸为主。乙酸有延缓衰老、消除疲劳和降低血压等功能。乳酸是一种化学抑制物质，能够抑制致病菌的生长，增强人体抵抗力[2]。还含有许多其他的有机酸组分，包括琥珀酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、富马酸等，其种类和含量与食醋的酸味质量及产品特色密切相关[3]。

食醋中的有机酸主要是由发酵过程中存在的酵母菌、醋酸菌、芽孢杆菌、乳酸菌等多种微生物通过三羧酸或丙酮酸循环代谢而形成。乳酸等有机酸的存在能够缓解发酵食醋中乙酸带来的强烈刺激性，从而赋予食醋酸味柔和、回味绵长的口感特点。目前，对食醋中微生物的研究有了一定的进展，2013年，韩志双等[4]在传统麸醋醋醅中分离了一株产香酵母并对其生长特性进行了研究，结果表明在适宜条件下，其产酒精能力达到0.8825 mL/dL，产酯量达到3.66 g/L。2014年，郇阿梅等[5]对一株分离至传统麸醋醋醅的芽孢杆菌以总黄酮和总酚为指标进行了发酵特性研究，结果表明在最适发酵条件下总酚含量可达229.8 μg/mL，总黄酮含量可达241.9 μg/mL。但是对四川麸醋中产酸细菌的研究报道还较少。研究醋醅中产酸细菌的生长与发酵特性不仅可以为大规模工业化生产提高食醋的出醋率提供理论数据支撑，还有利于分析食醋风味形成的机理。

本研究采用稀释平板法从四川麸醋醋醅中筛选出产酸能力强的优势产酸菌，并进行分子生物学鉴定，研究分离菌株在不同温度、发酵初始pH值、培养时间等条件下对菌体增殖及产酸能力的影响，分析其有机酸组成，以期为后续探讨四川麸醋有机酸的形成机制提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料与试剂

原材料：四川某醋厂醋醅。

试剂：氢氧化钠、氯化钠、邻苯二甲酸氢钾、磷酸氢二铵、磷酸、葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、柠檬酸、酒石酸、乳酸等，以上药品均为分析纯；草酸、甲酸、乙酸，以上药品均为色谱纯。

1.1.2 培养基

1.1.2.1 富集培养基

可溶性淀粉3 g，蛋白胨10 g，酵母膏3 g，磷酸二氢钾1.5 g，磷酸氢二钾2 g，硫酸镁0.1 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.2，121 ℃灭菌20 min。

1.1.2.2 分离培养基

牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，碳酸钙20 g，蒸馏水1 L，pH 7.0～7.2，121 ℃灭菌20 min。

1.1.2.3 发酵培养基(MRS)

蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，磷酸氢二钾2 g，乙酸钠5 g，柠檬酸二铵2 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，吐温80 1 mL，蒸馏水1000 mL，121 ℃灭菌20 min。

1.1.3 仪器与设备

LRH-250恒温培养箱、洁净工作台、立式自动压力蒸汽灭菌锅、BH200生物显微镜、CP214电子天平、0.45 μm水系微孔滤膜、数控超声波清洗器、电热恒温鼓风干燥箱，紫外分光光度计、pH计、电泳仪、凝胶成像系统、PCR仪、高效液相色谱仪。

1.2 方法

1.2.1 产酸细菌的分离纯化

取5 g四川麸醋醋醅于100 mL无菌蒸馏水中，充分震荡5～10 min，取上清液2 mL接种于100 mL富集培养基中，在转速120 r/min，37 ℃下震荡培养48 h。取1 mL增殖培养液，以10倍浓度梯度稀释后，取适当浓度的菌悬液于分离培养基上进行平板涂布，37 ℃培养48 h，然后观察并记录各平板中菌落形态以及培养基上透明圈的大小等形态，从不同平板上挑取长势良好、透明圈较大的典型单菌落进行进一步的纯化。

1.2.2 分离菌株复筛

将所分离纯化的菌株接种于发酵培养基中，37 ℃培养24 h，以总酸为指标，测定各菌株的产酸能力，并最终筛选出产酸能力较强的菌株。

1.2.3 菌株分子学鉴定[6]

分离菌株DNA提取采用冻融法，PCR扩增后，将产物送往上海杰李生物技术有限公司进行测序。

1.2.4 分离菌株系统发育树的构建

将菌株序列在GenBank数据库中进行BLAST同源性比对分析，运用MEGA 6.0软件构建系统发育树，根据菌株间的亲缘关系确定所选菌株的种属。

1.3 分离菌株发酵特性研究

1.3.1 分离菌株生长曲线测定

将分离菌株活化后接种于发酵培养基中，37 ℃下进行培养，以未接种的发酵培养基做空白对照，每隔2 h采用紫外分光光度计在波长600 nm处测定其菌体浓度即OD值。

1.3.2 产酸曲线的测定

接种2 mL种子液于100 mL无菌发酵培养基中，37 ℃下进行培养，每隔4 h取出一瓶发酵液，采用酸碱中和滴定法测定其总酸含量[7]，绘制产酸速率曲线，以确定后续试验测定总酸的培养时间。

1.3.3 温度对分离菌株生长及产酸能力的影响

接种2 mL种子液于100 mL无菌发酵培养基中，于20，25，30，35，40，45，50 ℃下培养20 h，以未接种的无菌发酵培养基为空白对照，测定其生长量和产酸能力，并绘制相应曲线。

1.3.4 培养基初始pH对分离菌株生长及产酸能力的影响

接种2 mL种子液于初始pH值分别为3.5，4.5，5.5，6.5，7.5，8.5，9.5的100 mL无菌发酵培养基中，37 ℃培养20 h，以未接种的相应pH值无菌发酵培养基为空白对照，测定其生长量和产酸能力，并绘制相应曲线。

1.3.5 分离菌株发酵产酸正交试验优化

在单因素试验的基础上，为了获得该菌株最适生长条件和最适产酸条件，选取影响细菌生长以及产酸能力的各因素中有意义的水平做正交试验，对结果进行分析，以确定最佳条件。采用L9(34)正交表，分别以培养时间、培养基初始pH、培养温度作为3个参考因素，选取3个水平进行试验。按表1的正交因素水平设计L9(34)正交试验。

表1 L9(34)正交试验因素水平表

1.4 分离菌株发酵液中有机酸的测定

1.4.1 样品预处理

取5 mL发酵液于100 mL容量瓶中，加入2 mL亚铁氰化钾溶液(10.6%)和2 mL硫酸锌溶液(30%)，摇匀后，用超纯水定容，静置30 min后，先用双层滤纸过滤，再用0.45 μL微孔滤膜过滤，所得滤液用于高效液相色谱分析[8,9]。

1.4.2 标准曲线制作

配制一系列的有机酸标准溶液，将各种有机酸标准溶液在相同的液相色谱条件下分别进样。再将所有有机酸的混和标准溶液稀释不同倍数，将不同稀释倍数的有机酸混合标准溶液在相同的液相色谱条件下分别进样。对照单一有机酸标准溶液的液相色谱分析结果和不同稀释倍数的混合有机酸标准溶液的液相色谱分析结果，以保留时间和样品加标的有机酸定性，以峰面积外标法定量，绘制各有机酸浓度半峰面积的标准曲线。

1.4.3 高效液相色谱条件

色谱柱：Hypersil ODS C18(2，5 μm，4.6 mm×200 mm)；柱温：30 ℃；流动相：0.01 mol/L NaH2PO4，用磷酸调节pH至2.7，使用前经0.45 μm微孔滤膜过滤；进样体积：10 μL；流速：0.5 mL/min；检测器波长：210 nm。

2 结果与分析

2.1 分离菌株鉴定

2.1.1 分离菌株形态学鉴定

在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中加入2%的碳酸钙做产酸指示，通过浇注平板法培养，挑取透明圈较大的细菌进行划线纯化，最终得到5株产酸细菌，其菌落形态为：凸起，乳白色，湿润，边缘不整齐。革兰氏染色为紫色，其细胞形态为杆状。

2.1.2 分离菌株复筛

将各分离菌株接种到发酵培养基中，37 ℃培养24 h，取发酵液测定其总酸，产酸量见图1。

图1 5株菌的产酸结果

由图1可知，产酸量较大的依次序分别是命名为S5，S4，S1的菌株。故选定S5菌株，并做后续试验。

2.1.3 分离菌株分子生物学鉴定

望亭水利枢纽是望虞河上的一项关键性工程，同时又是环太湖大堤重要口门控制工程，对太湖流域防洪、排涝、引水和航运发挥着重要作用。工程为2级建筑物，于1993年12月基本建成。2006年太湖局直管工程远程监控系统建成并运行，2011年对该监控系统进行了更新改造，实现对闸门的自动化控制、工程运行管理的视频监视以及异地视频会商等功能。

菌株DNA及PCR扩增电泳图见图2和图3。

图2 DNA电泳图

图3 PCR扩增产物电泳图

注：A为阳性对照，B为阴性对照，C为菌株S5的DNA扩增产物。

2.1.4 分离菌株系统发育树构建

将测出的序列在NCBI上进行BLAST比对，下载与此序列同源性高的序列，经MEGA 6.0软件采用Neighbor-Joining(NJ)法将测定的序列与在NCBI网站上的GenBank中下载的序列进行分析，构建系统发育树，获得目的菌的分类地位和它的系统发育地位，见图4。

图4 系统发育树

由图4可知，分离菌株S5被鉴定为产酸芽孢杆菌(Bacillusacidiproducens)。

2.2 分离菌株发酵特性研究

2.2.1 分离菌株生长曲线测定

以吸光度为纵坐标，时间为横坐标，绘制该菌株的生长曲线，见图5。

图5 菌株生长曲线

2.2.2 分离菌株产酸速率曲线测定

以总酸含量为纵坐标，时间为横坐标，绘制该菌株的产酸曲线，见图6。

图6 菌株的产酸速率曲线

由图6可知，该菌株在培养的24 h中，总酸量一直在上升，但在20 h后上升缓慢，趋于稳定。因此，在后续实验中都选择250 mL三角瓶，100 mL培养基，恒温培养20 h后测定总酸以及生长情况。

2.2.3 温度对分离菌株生长及产酸能力的影响

环境温度可影响微生物的生长及生化代谢过程，同时影响基质的利用和代谢产物的释放。在发酵培养基中接种2 mL种子液，不同温度下，培养20 h，以未接种的无菌发酵培养基为空白对照，测定其生长量和产酸能力，见图7。

图7 不同温度对菌株生长及产酸的影响

该菌株在温度为45 ℃时生长情况最好，同时，在温度为45 ℃时产酸量也达到最大值。

2.2.4 培养基初始pH对分离菌株生长及产酸能力的影响

pH可影响微生物的生长和代谢产物的释放。在不同初始pH的发酵培养基中接种2 mL种子液，37 ℃培养20 h，测定其生长量和产酸能力，见图8。该菌株在pH为6.5时生长情况最佳，而在pH为5.5时产酸量最大。

图8 不同初始pH对菌株生长及产酸的影响

2.2.5 分离菌株产酸正交试验优化

根据单因素试验结果，选取影响细菌生长以及产酸能力的各因素中有意义的水平做正交试验，对结果进行分析，以确定最佳条件。设计L9(34)正交试验，结果见表2。

表2 S5菌株L9(34)正交试验设计及结果

由表2数据先算出总变异的自由度和平方以及分解为各变异原因的自由度和平方和；列出方差分析表，计算各项均方及有关均比方，做出F检验，以明了各变异因素的重要程度，见表3。

表3 方差分析表

由表3可知，培养温度、培养基初始pH和培养时间3个因素对分离菌株产酸能力的影响中培养温度的影响较大，培养基初始pH的影响最小，但是这3个因素对分离菌株产酸能力的影响都不显著。究其原因可能是误差自由度小(仅为2)，使检验的灵敏度低，从而掩盖了考察因素的显著性。由于各因素对产酸能力的影响都不显著，不必再进行各因素水平间的多重比较。此时，可从表2中选择平均数大的水平A3，B2，C1组合成最优水平组合A3B2C1，即细菌培养时间为24 h，细菌培养温度为45 ℃，培养基初始pH为4.5，在此发酵条件下S5菌株的产酸量可达到610.5 mg/dL。

2.3 分离菌株发酵液中风味物质的测定

2.3.1 有机酸标准曲线

以保留时间和样品加标的有机酸定性，以峰面积外标法定量，绘制各有机酸浓度-峰面积标准曲线，见表4。

表4 有机酸标准曲线

2.3.2 分离菌株发酵液中有机酸分析结果

表5 分离菌株发酵液中有机酸测定结果

注：“-”表示未检出。

由表5可知，该菌株的发酵液中检测出3种有机酸，分别是酒石酸、甲酸和柠檬酸，其含量分别为0.270 mg/mL发酵液、1.658 mg/mL发酵液、2.284 mg/mL发酵液。由于试验原因，配制的有机酸标品溶液的种类可能较少，只检测出3种有机酸，而液相分析结果中其他对应的峰不能确定为何种物质，因此发酵液中可能还存在其他有机酸成分。同时，检测出的这3种有机酸也是四川麸醋中主体香味物质，能与食醋中醋酸相互作用，降低食醋的刺激性，对食醋的口感起到重要作用。

3 结论

本研究对四川麸醋醋醅中产酸细菌进行了分离鉴定，并对其发酵特性进行了研究。采用浇注平板法和平板划线法对四川麸醋醋醅中的产酸细菌进行分离纯化，以总酸为指标，筛选出一株产酸能力较强的菌株，并通过16S rDNA 同源序列分析对该菌株进行遗传学鉴定，确定该株菌为产酸芽孢杆菌(Bacillusacidiproducens)。以不同的发酵温度、初始pH值做单因素试验研究其生长情况和产酸能力。并在单因素试验的基础上，通过正交试验法，分别以培养时间、培养基初始pH、培养温度作为3个参考因素，选取3个水平进行试验。获得该株菌最优产酸条件分别为培养时间24 h，培养温度45 ℃，培养基初始pH 5.5。同时研究了该株菌发酵液中有机酸成分，其成分为酒石酸、甲酸和柠檬酸，含量分别为0.270，1.658，2.284 mg/mL。

[1]余永建.镇江香醋有机酸组成及乳酸合成的生物强化[D].无锡:江南大学,2014.

[2]邓朝霞.永春老醋发酵过程中有机酸和生物胺变化分析及其细菌菌群结构分析[D].福州:福建师范大学,2014.

[3]Wu J J,Ma Y K,Zhang F F,et al.Biodiversity of yeasts，lactic acid bacteria and acetic acid bacteria in the fermentation of "Shanxi aged vinegar",a traditional Chinese vinegar[J].Food Microbiology,2012,30(1):289-297.

[4]韩志双,刘军,黄思敏,等.传统麸醋醋醅中一株产香酵母的筛选鉴定及生长特性研究[J].中国调味品,2013,38(10):41-45.

[5]郇阿梅,刘军.一株分离至传统麸醋醋醅芽孢杆菌发酵特性研究[J].中国调味品,2014,39(8):23-28.

[6]黄丹,梁源,左勇,等.酱油发酵酱醅中耐盐乳酸菌的分离筛选及产酸特性[J].食品与生物技术学报,2014,33(6):652-656.

[7]GB/T 5009.41-2003,食醋卫生标准的分析方法[S].

[8]张丽娟,许伟,许泓瑜.恒顺香醋固态发酵过程中有机酸的变化分析[J].中国调味品,2009,34(2):106-109.

[9]余永建,邓晓阳,陆震鸣.高效液相色谱法定量分析固态发酵食醋中有机酸的方法优化[J].食品科学,2014(4):55-59.

Research on the Characteristics of Acid Production and Separation of Acid-producing Bacteria from Sichuan Bran Vinegar

YU Hua1, HUANG Dan1*, OU Jun-mo2, CHEN Zhuo1, TANG Jiao1

(1.College of Bioengineering, Sichuan University of Science and Engineering, Zigong 643000,China;2.Luzhou Huguo Mature Vinegar Co., Ltd., Luzhou 646318, China)

A dominant strain is screened with strong acid-producing ability by using Sichuan bran vinegar as research object, and the characteristics of acid production are explored. The acid-producing bacteria are isolated from Sichuan bran vinegar by using the traditional separation method including plate coating line and plate biochemical reaction,and then through determination of acid production ability for secondary screening, the strains are identified by using the morphological and genetic characteristics, and through the single factor experiments and orthogonal test, the optimum fermentation conditions are studied, the organic acids in the fermented broth of strains are analyzed by using high performance liquid phase chromatography. The results show that the strain which has stronger acid-producing ability isBacillusacidiproducens, the optimum fermentation conditions are the incubation time of 24 h, culture temperature of 45 ℃, initial medium pH of 4.5,the acid-producing ability could reach 0.6105 g/dL. Three kinds of organic acids are detected in the fermented broth, including tartaric acid, formic acid and citric acid, the content is 0.270,1.658,2.284 mg/mL respectively.

bran vinegar; acid-producing bacteria; molecular biological identification; acid-producing characteristics

2016-11-05 *通讯作者

固态酿造关键技术研究四川省院士(专家)工作站资助项目(GY2015-02)；四川省经信委企业技术创新专项(2015XM080)；四川理工学院研究生创新基金(y2015013)

于华(1991-)，男，四川绵阳人，硕士，主要从事固态酿造功能微生物方面的研究； 黄丹(1968-)，女，四川自贡人，教授，主要从事微生物及应用方面的研究。

TS264.22

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.05.008

1000-9973(2017)05-0036-06