光照对霍山石斛次生代谢产物积累的研究

司华阳，陈乃富，陈乃东，刘国瑞，王 娜

(1.安徽中医药大学 药学院，安徽 合肥 230032；2.皖西学院 生物与制药工程学院，安徽 六安 237012；3.皖西中药与天然药物工程技术研究中心，安徽 六安 237012)

光照对霍山石斛次生代谢产物积累的研究

司华阳1，2，陈乃富2，3，陈乃东2，3，刘国瑞2，王 娜2

(1.安徽中医药大学 药学院，安徽 合肥 230032；2.皖西学院 生物与制药工程学院，安徽 六安 237012；3.皖西中药与天然药物工程技术研究中心，安徽 六安 237012)

通过比较红蓝光和LED光照处理对霍山石斛根、茎、叶中脂溶性多糖、水溶性多糖及多酚的含量的影响。结果表明：在本实验条件下，红蓝光光照处理的霍山石斛，不同部位水溶性多糖、脂溶性多糖及多酚含量依次为：根<叶<茎、根<茎<叶、根<茎<叶；LED光照处理的霍山石斛不同部位水溶性多糖、脂溶性多糖及多酚含量为：根<叶<茎、根<茎<叶、根<叶<茎；对结果进行初步分析，为霍山石斛资源的合理开发应用提供理论依据。

霍山石斛；不同光照；水溶性多糖；脂溶性多糖；多酚

霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseTangetCheng)又称米斛，主产于大别山安徽霍山县等地，是兰科石斛属的草本植物。霍山石斛有厚肠胃、生津益胃，平胃气，长肌肉，益智除惊，轻身延年，抗肿瘤、降糖保肝和抗白内障[1-4]等多种功效。由于霍山石斛生长环境特殊及人工采集过度，其野生资源已处于濒临灭绝境况[5-6]。药用植物的有效成分通常都是植物次生代谢产物，其含量高低与药材品质息息相关[7]。目前石斛组培技术已经取得一定的进展，但能找到获得更大药用价值的培养条件也对霍山石斛研究与发展有重要的意义。本实验通过比较红蓝光和LED光对组培霍山石斛中水溶性多糖、脂溶性多糖及多酚三种次生代谢产物含量影响的研究，为霍山石斛资源产业化提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

经红蓝光照条件处理的霍山石斛和LED光灯光照处理的霍山石斛(均为两年生霍山石斛)，来自实验室人工气候室。

RE-52D型旋转蒸发器(上海浦沪仪器厂)；TU-1901双光束紫外-可见分光光度计(北京市普析通用仪器有限公司)；HH-S6型数显恒温水浴锅(江苏金坛市金城国胜实验仪器厂)；GL-200-ll型离心机(上海市安亭科学仪器厂)；GL-20G-ll电子分析天平(上海安亭科学仪器厂)；索氏提取器(天长市千波教学仪器有限公司)。

葡萄糖(SIGMA试剂公司)；无水乙醇(AR上海振兴化工一厂)；三氯甲烷、丙酮、浓硫酸(AR汕头市西陇化工厂股份有限公司)；α-萘酚(AR北京瀛海精细化工厂)；蒽酮(AR天津市科密欧化学试剂有限公司)；无水乙醚(AR上海振兴化工一厂)；甲醇(GR上海星可生化有限公司)；福林酚(AR北京梦怡美生物科技有限公司)；没食子酸(AR上海金穗生物科技有限公司)。

1.2 脂溶性多糖的提取

取不同光照条件下处理的石斛根茎叶分离、切成薄片，薄片置于干燥箱中45 ℃干燥至恒重，粉碎，过20目筛，以95%乙醇，85 ℃回流提取1 h。离心、合并上清液，得到乙醇总浸出物溶液，加入95%乙醇定容，沉淀残渣物收集，备用。

1.2.1 脂溶性多糖的含量测定

精确移取各供试样品的乙醇浸出液1.5 mL分别置于清洁的青霉素瓶中，于40 ℃恒温干燥箱中干燥至恒重，称重，计算供试样品脂溶性多糖得率，计算公式如下：

脂溶性多糖得率(%)=M×V/W×100%

式中M代表1.5 mL乙醇浸出液干燥后质量(mg)；V代表乙醇浸出液总体积；W代表样品重量(mg)。

1.3 水溶性多糖的提取

石斛多糖采用热水浸提工艺提取，粗多糖采用Sevag法脱蛋白[8-9]。取适量1.2实验所得滤渣，于90 ℃热水浴中浸提2 h(1∶15)，重复3次，过滤、合并提取液，旋转蒸发仪60 ℃减压浓缩至1/3原体积，冷却至室温。加入3倍体积的无水乙醇，4℃冰箱内静置过夜，离心收集沉淀物，干燥后即得到组培霍山石斛粗多糖。多糖提取液中的蛋白质用三氯甲烷-正丁醇(V∶V=4∶1)混合液萃取多次至萃取液澄清，合并水相萃取液，280 nm处紫外检测有无蛋白质吸收峰，加入3倍体积的无水乙醇，离心，收集沉淀物，所得沉淀物先后用无水乙醇、丙酮、无水乙醚相继洗涤，烘干后制得组培霍山石斛精制多糖。

1.3.1 葡萄糖标准曲线的绘制

精确称取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖10 mg，蒸馏水溶解配制成浓度为0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液。分别量取0.1 mg/mL葡萄糖标准品溶液0.0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL于10支具刻度线试管中，加水至1.0 mL摇匀。冰水浴条件下向各管中加入4.0 mL蒽酮-硫酸[10-12]溶液，震荡摇匀，于沸水浴中加热10 min，冷却至室温，621 nm处检测吸光度。以标准葡萄糖浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，采用线性回归方法，作标准曲线求回归方程。

1.3.2 多糖换算因子的测定

精确称取干燥至恒重的精制组培霍山石斛多糖样品10 mg，配成浓度为0.1 mg/mL的石斛多糖溶液，按1.3.1方法检测其吸光度，代入回归方程，算的多糖含量，另取1 mL于40 ℃烘箱中干燥至恒重，测定质量，由以下公式计算多糖的换算因子。

换算因子：f=W/C×D

式中W代表干燥至恒重精制多糖的量(mg)；C代表多糖液中折合标准葡萄糖溶液的浓度(mg/mL)；D代表稀释因素。

1.3.3 水溶性多糖含量的测定

精确吸取组培霍山石斛水提液1.0 mL，按1.3.1方法测定吸光度值，将其吸光度平均值代入回归方程求出多糖含量，由以下公式计算出石斛中多糖含量。

多糖含量(%)=C·D·F/W×100%

式中W代表样品的重量(mg)；C代表多糖液中折合标准葡萄糖溶液的浓度(mg/mL)；D代表稀释因素；F代表换算因子。

1.4 多酚的提取

取不同光照条件下处理的石斛根茎叶分离、切成薄片，薄片置于干燥箱中45 ℃干燥至恒重，粉碎，过20目筛，取一定量的不同方法处理的石斛根、茎和叶粉末，置于250 mL烧瓶中，按料液比1∶15(g/mL)加80%乙醇,冷凝回流提取，80 ℃条件下回流提取3次，每次1.5 h[13-14]。合并提取液，再将合并的提取液用旋转蒸发仪器浓缩至适量，然后将浓缩液放置于烧杯中挥去剩余乙醇，最后将提取液用倒入容量瓶并用蒸馏水定容得总多酚提取液，4 ℃保存，备用。

1.4.1 没食子酸标准曲线的制备

精取没食子酸标准品25 mg，用蒸馏水溶解并定容至1 000.0 mL配置成25 ug/mL的没食子酸标准溶液。采用Folin-Ciocalteu比色法测定样品中总多酚的含量。分别取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5、3.0 mL没食子酸标准品于10 mL容量瓶中，依次加入2.5 mL福林酚试剂，2 mL 7.5%的NaCO3(4～6 min内)和1 mL甲醇最后加蒸馏水至10 mL[15]，在昏暗中反应60 min，然后在517 nm处测定吸光度值(A)。以吸光度值为纵坐标(Y)，多酚含量为横坐标(X)。测定没食子酸标准曲线。

1.4.2 石斛多酚含量的测定

取1.0 mL多酚总提液加2.5 mL福林酚试剂2 mL 7.5%的NaCO3(4～6 min内)和1 mL的甲醇于10 mL容量瓶中，加蒸馏水至10 mL，在黑暗中反应60 min，然后在517 nm处测定吸光度，以蒸馏水为空白对照。将所测吸光度值代入回归方程，计算不同光照处理的霍山石斛根、茎和叶多酚的含量。

1.5 数据处理

实验所有数据均取三次平行实验的平均值。

2 结果分析

2.1 不同光照多霍山石斛中脂溶性多糖得率影响

由图1可知，不同光照条件对霍山石斛根、茎、叶中脂溶性多糖得率具有显著影响。红蓝光组霍山石斛根、茎、叶中脂溶性多糖得率明显低于LED光照组，同组光照处理的霍山石斛根茎叶中脂溶性多糖的得率依次递增，叶中所含的脂溶性多糖得率最高。LED光照处理的霍山石斛根茎叶中，不同部位之间所含的脂溶性多糖增长趋势平稳，保持约2%的增长率。红蓝光处理的霍山石斛根茎叶中，叶中脂溶性多糖得率的增长率相较于茎中较高，说明红蓝光处理对叶中脂溶性多糖合成的影响较根茎更为显著。

图1 不同光照下霍山石斛中脂溶性多糖的得率

2.2 不同光照对霍山石斛中水溶性多糖含量的影响

由图2可知，LED光组和红蓝光组处理的霍山石斛茎中所含的水溶性多糖含量最高，其次为叶，根中水溶性多糖含量相对较少。LED光处理的霍山石斛茎中的水溶性多糖含量高于红蓝光组，其根、叶中所含的水溶性多糖含量比红蓝光组低。相较于根叶中水溶性多糖LED光照组茎中水溶性多糖含量的增长率分别为238%、85%，远高于红蓝光组茎中水溶性多糖的增长率112%、37%。

图2 不同光照下霍山石斛中水溶性多糖的含量

2.3 不同光照对霍山石斛中多酚含量的影响

由图3可知，LED光照处理的霍山石斛根茎叶中的多酚含量明显高于同部位红蓝光处理的霍山石斛，茎中的多酚含量最高，其次为叶，红蓝光处理的霍山石斛根、茎、叶中所含的多酚含量依次递增，两组不同光照处理的霍山石斛根、茎、叶中的多酚含量呈现两种不同的增长趋势，可能是由于光照不同影响植物的代谢从而影响多酚的产生。两组光照处理的石斛茎中所含的多酚含量有较为明显的差异，相差0.71%，多酚含量增长率约为82%，明显高于根、叶中多酚含量的增长率(7%、15%)。

图3 不同光照下霍山石斛中多酚的含量

图4 不同光照下霍山石斛植株中脂溶性多糖的总得率及水溶性多糖和多酚的总含量

3 讨论

由图表分析可知，光照条件不同对组培霍山石斛次生代谢产物的累积具有明显的影响，LED光照处理的霍山石斛根、茎、叶中脂溶性多糖的总得率及水溶性多糖和多酚的总含量较优于红蓝光组(见图4)，而药物的疗效基础与其自身合成的次生代谢产物密不可分。两组光照处理的霍山石斛茎中水溶性多糖量明显高于根、叶中的含量，且植株中的水溶性多糖含量明显高于多酚及脂溶性多糖的含量及得率，现代药理研究表明，多糖具有多种药理活性，因此从药用角度考虑，以霍山石斛茎入药更为合理，且LED光照处理的组培霍山石斛更有利于次生代谢产物的积累，提高组培石斛的药用品质。

[1]孟海涛，何祥林，张淇军，等.山石斛产业发展的现状与对策分析[J].中国现代医药，2015，17(6)：521-524.

[2]吴胡琦，罗建平.霍山石斛的研究进展[J].时珍国医国药，2010，21(1)：208-211.

[3]周旋，周海燕，李向东，等.霍山石斛商品质量研究现状和发展趋势[J].中国现代中药，2015，17(6)：533-539.

[4]陈存武，戴军，姚厚军，等.霍山石斛资源与鉴定研究进展[J].现代中药研究与实践，2013，27(3)：84-87.

[5]李蕤，谭晓芳，陈群.霍山石斛细胞悬浮培养及条件优化[J].中草药，2011，42(2)：358-361.

[6]吕素芳，郭广君，蔡永萍.石斛生理生化性质的研究进展[J].中草药，2006，37(5)：790-793.

[7]房慧勇，朱虹，丁海麦，等.影响愈伤组织中次生代谢产物含量的因素研究进展[J].中国中药杂志，2014，39(15)：2846-2850.

[8]He T G, Yang L T , Li Y R,et al.PhysicochemicalProperties and Antitumor Activity of Polysaccharide DCPPla-1 from Suspension-culture Protocorms of Dendrobium Candidun[J].Natural Product Research Development,2007,19(4):410-414.

[9]Chen Z G, Ye S S, Fan Y, et al.Optimization of Extraction Technology of Polysaccharide from Dendrobium Nobile and Effects on Pro-liferation of Mouse Splenocytes[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2011,17(5):28-29.

[10]Yang Y, Sui W W, Zhou C，et al. Optimization ofWater-soluble Polysaccharides Extraction from Rhizome of Polygonatum Odoratum using Response Surface Methodology and its Antioxidant Activities in Vitro[J].Journal of Food Science and Biotechnology,2013,32(3):200-203.

[11]张庆红，马梅芳.硫酸-蒽酮法测定天冬中多糖含量[J].中国现代中药，2008，22(8)：18-19.

[12]王黎明，夏文水.蒽酮硫酸法测定茶多糖的研究[J].食品科学，2005，26(7)：185-187.

[13]陈乃东，朱旺生，陈乃富，等.栽培年限对亳芍多酚物质积累的影响研究[J].天然产物研究与开发，2015(27)：52-55.

[14]陈乃东，陈翰，于丹，等.亳芍多酚提取工艺及栽培年限对总多酚积累的影响研究[J].天然产物研究与开发，2015(27)：135-139.

[15]Moretti M, Cossignanib L, Messina F, et al. AntigenotoxicEffect, Composition and Antioxidant Activity ofDendrobiumSpeciosum[J].Food Chemistry,2013(140): 660-665.

Study on the Accumulation of the Secondary Metabolitesin Dendrobium Huoshanense by Light

SI Huayang1,2, CHEN Naifu2,3, CHEN Naidong2,3,LIU Guorui2, WANG Na2

(1.SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine,Hefei230012,China;2.CollegeofBiotechnologyandPharmaceuticalEngineering,WestAnhuiUniversity,Lu’anCity237012;3.WestAnhuiBiotechnologyResearchCenterofNaturalMedicineandTraditionalChineseMedicine,WestAnhuiUniversity,Lu’anCity237012)

By comparing the effects of the red and blue light and LED light treatment to the content of fat soluble polysaccharide, water soluble polysaccharide and polyphenol of dendrobium huoshanense in the three parts of roots, stems and leaves. Experimental results show that the content of Dendrobium huoshanense lipid-soluble polysaccharides, water-soluble polysaccharides and polyphenols were root

dendrobium huoshanense; different light; water soluble polysaccharide; fat soluble polysaccharide; polyphenol

2017-04-08

国家自然科学基金(81573536、81274021)；安徽省自然科学基金面上项目(1608085MH221)；安徽省教育厅自然科学研究重点项目(KJ2016A886)；安徽省自然科学研究重大项目(2015ZD043)；中国博士后基金特别资助(2016T90568)。

司华阳(1990-)，男，安徽巢湖人，硕士研究生，研究方向：植物化学；陈乃东(1972-)，男，安徽六安人，博士后，副教授，研究方向：中药与天然药物活性成分分离鉴定、药物活性成分结构修饰及其构效关系。通信作者：陈乃富(1962-)，男，安徽六安人，教授，硕导，研究方向：中药生物技术、中药资源与质量研究。

R284

A

1009-9735(2017)02-0014-04