一例仔猪致病性大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验

2017-05-12祖立闯谢金文姚春阳齐继红赵家磊沈志强

养猪 2017年2期

关键词：病料致病性禽流感

祖立闯，谢金文，姚春阳，孟霞，齐继红，赵家磊，李峰，沈志强，

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，滨州 256600）

一例仔猪致病性大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验

祖立闯1，谢金文2，姚春阳2，孟霞1，齐继红1，赵家磊1，李峰2，沈志强1，2

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，滨州 256600）

为确定仔猪的死亡原因并为猪场及时制定防控措施提供参考依据，对病料样品进行镜检观察、细菌分离培养与纯化、分离菌株的形态特征观察、生化试验、致病性试验、16S rRNA序列鉴定等，最终鉴定为仔猪致病性大肠杆菌。药敏试验结果显示，分离菌株在13种常见药物中对环丙沙星、头孢曲松钠、阿奇霉素、氧氟沙星、头孢噻呋、头孢噻肟、阿莫西林、氟苯尼考8种药物高度敏感，对红霉素、阿米卡星、庆大霉素3种药物中度敏感，对强力霉素、四环素2种药物低度敏感。

仔猪；大肠杆菌；分离鉴定；药敏试验

猪大肠杆菌病是由致病性大肠埃希氏菌的某些血清型及其毒素引起的一种肠道传染性疾病，主要危害仔猪，可引起仔猪生长发育迟缓，生产性能低下，甚至造成死亡，是目前危害仔猪生长发育的主要疫病之一，每年都给养猪业造成一定的经济损失[1-2]。该病的流行无明显季节性，但一般在过于潮湿炎热的夏季和极其寒冷的冬季易发生，而在温暖的春季和秋季较少发生[3]。2016年8月，连续多日降雨过后，山东省滨州市某猪场饲养的2～3月龄仔猪发病，表现为呼吸困难，厌食，精神萎靡，体温升高，肝脏和肾脏坏死、有出血点，根据临床症状和剖检病理变化初步诊断为疑似大肠杆菌感染。为进一步确诊，本研究进行了病料样品的镜检观察、细菌的分离与鉴定等实验室诊断，并对分离菌株进行了药敏试验。

1 材料与方法

1.1 临床病料样品的采集

对病死猪进行解剖，无菌采集病死猪的肝脏、肾脏、脾脏等病变组织，低温条件运往实验室。

1.2 实验室检测时间与地点

实验室检测于2016年8月26日至2017年1月18日在山东省滨州市预防兽医学与动物生物技术重点开放实验室进行。

1.3 培养基、试剂、试剂盒、试验动物

麦康凯琼脂、营养琼脂、营养肉汤购自北京中海生物科技有限公司；细菌生化反应管购于杭州天和微生物试剂有限公司；药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京百泰克生物科技有限公司；Taq酶、dNTP、DL 2 000 DNA Marker购自宝生物工程（大连）有限公司；健康昆明系小白鼠购自山东省实验动物中心。

1.4 病料样品的镜检观察

将采集的病料样品涂片，革兰氏染色，镜检观察是否存在可疑细菌。

1.5 细菌分离培养与纯化

将采集的病料样品分别接种于麦康凯琼脂平板和营养琼脂平板，37℃培养至24 h，观察菌落特征。挑取单菌落连续传代纯化至菌落大小与形态均一。

1.6 分离菌株的形态特征观察

取纯化后单菌落涂片，革兰氏染色，镜检观察形态特征。

1.7 分离菌株的生化试验

取分离菌株分别接种至各种生化鉴定管，按常规方法测定分离菌株的生化特性。

1.8 分离菌株致病性试验

取营养肉汤中培养的分离菌株腹腔接种20～22 g健康昆明系小白鼠10只，0.2 mL/只，同时取10只小白鼠接种营养肉汤培养基作为对照，隔离饲养，观察至攻毒后7 d。

1.9 分离菌株16S rRNA序列鉴定

设计合成1对细菌16S rRNA基因通用型检测引物（上游引物序列：5′-TCAGATTGAACGCTGGCG G-3′；下游引物序列：5′-CACCCCAGTCATGAATCAT -3′）。参照细菌基因组DNA提取试剂盒使用说明提取分离菌株的基因组DNA。利用细菌16S rRNA基因通用型检测引物对分离菌株基因组DNA进行PCR扩增。PCR扩增体系：10×PCR Buffer 5 μL、dNTP 4 μL、上下游引物各1.0 μL、Taq酶1 μL、DNA 5 μL、补水至50 μL。PCR扩增程序：95℃5 min；95℃1 min，55℃1min，72℃2min，30个循环；72℃10 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化后送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，将测序结果与GenBank中登录的细菌基因组16S rRNA序列进行比对分析。

1.10 药敏试验

利用K-B涂布法测定分离菌株对环丙沙星等13种常见药物的敏感性，当抑菌环直径在15 mm以上判断为高度敏感，10～15 mm判断为中度敏感，10 mm以下判断为低度敏感，无抑菌环判断为耐药。

2 结果与分析

2.1 病料样品镜检结果

如图1所示，将采集的病料样品涂片，革兰氏染色，镜检可见革兰氏阴性菌小杆菌，单个或多数散在排列，无芽孢。

图1 临床病料样品革兰氏染色镜检结果

2.2 细菌分离培养与纯化结果

营养琼脂平板生长出圆形、光滑、半透明、隆起的灰白色菌落，麦康凯琼脂平板上长出圆形、光滑、边缘整齐、隆起的粉红色菌落。经连续传代纯化后，菌落大小均一，均呈圆形、光滑、边缘整齐、隆起。

2.3 分离菌株形态特征观察结果

如图2所示，纯化后单菌落涂片，革兰氏染色，镜检可见革兰氏阴性小杆菌。

图2 分离菌株革兰氏染色镜检结果

2.4 分离菌株生化鉴定结果

如表1所示，分离菌株符合大肠杆菌的生化特性。

表1 分离菌株的生化特性

2.5 分离菌株致病性试验结果

接种分离菌株的10只小白鼠在接种后2 h开始出现精神萎靡、厌食等症状，至接种后8 h 10只小白鼠已全部死亡。而对照组10只小白鼠均健活，精神与食欲均正常，未见任何不良反应。表明分离菌株具有较强的致病性。

2.6 分离菌株16S rRNA序列鉴定结果

如图3所示，分离菌株经16S rRNA通用型引物扩增后，在大小约为1 500 bp处具有特异性扩增条带，与试验预期结果相符。PCR扩增产物经序列测定表明为大肠杆菌16S rRNA基因特异性序列。

图3 分离菌株16S rRNA基因PCR扩增结果

2.7 药敏试验结果

如表2所示，分离菌株对环丙沙星等13种常见药物表现出了不同程度的敏感性，其中高敏药物8种，分别为环丙沙星、头孢曲松钠、阿奇霉素、氧氟沙星、头孢噻呋、头孢噻肟、阿莫西林、氟苯尼考；中敏药物3种，分别为红霉素、阿米卡星、庆大霉素；低敏药物2种，分别为强力霉素、四环素；无耐药药物；即分离菌株的高敏和中敏药物共计11种，分离菌株药物敏感率为84.62%（11/13）。虽然有2种药物为低敏药物，但未筛选出耐药性药物，分离菌株耐药性相对不严重。

表2 分离菌株对13种药物的敏感性

3 讨论

近年来，随着我国养猪业的规模化快速发展，仔猪大肠杆菌的发生与流行有明显增加的趋势[4]。因大肠杆菌为条件性致病菌，外界环境潮湿、寒冷、拥挤、饲料霉变等因素均易诱发本病，故对该病应采取预防为主的综合防控措施。在猪的日常饲养管理中应避受潮、受热、受寒、拥挤、刺激等，改善养殖环境，保持通风，定期消毒，搞好养殖卫生，严禁饲喂霉变饲料。由于大肠杆菌具有多种血清型，抗原比较复杂，且变异性较强，给使用疫苗防治该病增加了难度。在疫苗的选择上，养殖单位应结合当地近年来流行的优势血清型，选择与优势血清型一致的疫苗或多价联苗。目前，我国兽医临床中常使用抗菌药物进行细菌性疫病进行预防与治疗，而抗菌药物长期大量滥用必然导致耐药性的不断增强。我国研究学者对规模养猪场大肠杆菌的耐药性检测结果表明，我国部分地区猪大肠杆菌的耐药情况已非常严重[5-6]。本研究中的大肠杆菌分离菌株在13种常见药物中对环丙沙星等11种药物呈现出高度敏感或中度敏感，药物敏感率达84.62%（11/13），分离菌株耐药性相对不严重，这与该猪场平时不滥用抗菌药物密切相关。猪场应定期对当地的猪大肠杆菌病流行菌株进行血清型和耐药性监测，筛选出与之匹配的疫苗和敏感的治疗药物，避免抗菌药物的大量滥用，同时采用交叉用药或轮换用药的用药方式，在降低该病临床发病率的同时，降低耐药菌株的产生，保障动物源食品安全。

[1]姚淑红.猪大肠杆菌病及其流行特点[J].山东畜牧兽医，2016，37（6）：32.

[2] 谭娅，史开志，王婧，等.猪大肠杆菌病防治的研究进展[J].中国畜禽种业，2016（9）：127-129.

[3] 李占霞.猪大肠杆菌病的发病原因、临床症状和防控[J].现代畜牧科技，2016（9）：162.

[4] 桑友军.养猪场猪大肠杆菌的流行情况调查分析[J].当代畜禽养殖业，2016（12）：4-5.

[5] 曹敏，谭艾娟，吕世明，等.贵州部分地区猪源大肠杆菌耐药性分析及ESBLs基因型检测[J].中国畜牧兽医，2016，43（4）：1098-1104.

[6] 颜友荣，方向红，王琳琳.苏中地区猪大肠杆菌的耐药性与耐药基因的试验[J].中国兽医杂志，2016，52（2）：90-92.

（编辑：富春妮）

世卫呼吁严密监控禽流感

【路透社日内瓦1月23日电】世界卫生组织呼吁各国严密监控致命的禽流感疫情，及时报告可能预示着流感大流行的人类感染禽流感病例。

自去年底以来，不同菌株的禽流感在欧洲和亚洲传播，导致某些国家大规模灭杀家禽，中国出现了致人死亡的病例。

据世卫组织称，自去年11月以来，近40个国家报告了家禽或野生鸟类出现的高致病禽流感新疫情。

世卫组织总干事陈冯富珍在这个联合国机构为期10天的执行委员会会议开幕时说：“这些疫情迅速扩大的地理分布和当前同时传播的病毒菌株数量让世卫组织高度警惕。”