传染性胸膜肺炎放线杆菌和猪链球菌混合感染的诊断与防治

徐引弟，王治方，李海利，张青娴，朱文豪，焦文强，郎利敏，王克领

（河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南 郑州 450002）

传染性胸膜肺炎放线杆菌和猪链球菌混合感染的诊断与防治

徐引弟，王治方，李海利，张青娴，朱文豪，焦文强，郎利敏，王克领

（河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南 郑州 450002）

2016年3月初，河南省某规模化猪场肥育猪发病，经实验室诊断，分离到1株传染性胸膜肺炎放线杆菌和1株猪链球菌，对这两种菌分别进行了药敏试验。结果同时对这两种菌敏感的药物有：头孢哌酮、头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松、头孢唑啉、头孢呋辛、氧氟沙星和氯霉素。

传染性胸膜肺炎放线杆菌；猪链球菌；分离鉴定；药敏试验

2016年3月初，河南省某规模化猪场生长肥育猪突然发病，表现为高烧、呼吸困难、口鼻流泡沫，有的出血，死亡极快。剖检肺脏出血、间质增宽水肿、心内膜出血严重，其余脏器未见明显病变。根据发病及剖检情况初步怀疑为传染性胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）和猪链球菌（Streptococcus Suis,SS）混合感染。因此对这两种病原进行了实验室诊断，并对该混合感染病原进行了药敏试验，结果如下。

1 材料与方法

1.1 分离鉴定

1.1.1 分离纯化 无菌将病料（肺、气管、心血）接种于含NAD（Nicotinamide adenine dinucleotide，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）和血清的TSA（Tryptic Soy Agar，胰蛋白大豆琼脂）固体培养基，37℃培养12～24 h。分别挑取可疑菌落抹片革兰氏染色后在显微镜下观察。

1.1.2 培养特性 将可疑菌落分别接种不含NAD和血清的TSA、不含NAD但含血清的TSA平板，观察菌落生长情况和形态大小。

1.1.3 PCR鉴定 参照文献[1-2]，根据APP apxIV序列设计引物，上游引物：5-GCTCACCAACGTTTGCTC AT-3'，下游引物：5'-GGGGACGTAACTCGGTGATT-3'，PCR扩增的产物为377 bp大小的片段。参照文献[3-5]，根据猪链球菌gdh基因序列设计引物，上游引物：5-GCAGCGTATTCTGTCAAACG-3'，下游引物：5-CCATGGACAGATAAAGATGG-3'，PCR扩增的产物为689 bp大小的片段，引物由上海生工生物工程公司合成。反应体系（50 μL）：10×缓冲液5 μL， 2 mM dNTPs 1 μL，10 μM/L上下游引物各1 μL，TaqE 1 μL，模板（刮取少量新鲜菌落溶于生理盐水中）1 μL，灭菌ddH2O 40 μL。反应条件：94℃变性4 min，进入循环：94℃1 min，59℃1 min，72℃30 s，共35个循环，最后72℃延伸10 min，PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶进行电泳。

1.2 药敏试验

将分离鉴定好的细菌接种于绵羊全血平皿，涂匀，选取相应抗生素的药敏纸片贴于培养基上，于37℃培养24 h，测量抑菌环直径并判定结果。

2 试验结果

2.1 培养特性

培养24 h后，平皿上有2种菌落，一种稍大黄色不透明，革兰氏染色为革兰氏阴性短小球杆菌，多散在，少量短链或长链（图1）。大菌落在加有血清和NAD的TSA培养基上24 h长成半透明菌落，针尖大小，直径1～2 mm，侧对光线有虹光。在不含NAD和血清的TSA培养基、不含NAD但含血清的TSA培养基上均不能生长，表明分离的菌株具有NAD依赖性。在血平板上48 h长成针尖大小的半透明菌落，有溶血现象。另一种菌落较小，在加有血清的TSA培养基上24 h长成半透明菌落，针尖大小直径1～2 mm。在不含NAD和血清的TSA培养基上不能生长。在血平板上24 h长成针尖大小的半透明菌落，有α溶血现象。革兰氏染色为阳性球菌或球杆菌，散在或成双，部分形成短链（图2）。

图1 传染性胸膜肺炎放线杆菌菌体形态

图2 猪链球菌菌体形态

2.2 PCR鉴定

对第1种菌落进行APP的扩增，结果扩增出与预期大小一致的条带。对第2种菌落进行SS的扩增，也扩增出与预期大小一致的条带（图3）。

图3 APP和SS PCR扩增结果

综合以上鉴定结果，本次发病为传染性胸膜肺炎放线杆菌和猪链球菌的混合感染。

2.3 药物敏感试验

从药物敏感试验结果看，对传染性胸膜肺炎放线杆菌敏感的药物有：头孢哌酮、头孢噻肟、头孢他定、头孢克肟、头孢曲松、头孢唑啉、头孢呋辛、阿奇霉素、恩诺沙星、氧氟沙星、环丙沙星、氯霉素、壮观霉素。对传染性胸膜肺炎放线杆菌耐受的药物有：阿莫西林、氨苄西林、利福平、四环素、卡那霉素、红霉素、克林霉素、多西环素、庆大霉素、万古霉素、新霉素、复方新诺明、阿米卡星、林可霉素。

对猪链球菌敏感的药物有：头孢哌酮、阿莫西林、氨苄西林、头孢他定、氧氟沙星、头孢噻肟、头孢曲松、氯霉素、头孢唑啉、头孢呋辛、利福平、复方新诺明、青霉素G。对猪链球菌耐受的药物有：阿奇霉素、头孢克肟、四环素、卡那霉素、红霉素、恩诺沙星、克林霉素、多西环素、庆大霉素、万古霉素、新霉素、环丙沙星、阿米卡星、林可霉素、壮观霉素。

综合2种菌的药敏结果，对2种菌同时敏感的药物有：头孢哌酮、头孢噻肟、头孢他定、头孢曲松、头孢唑啉、头孢呋辛、氧氟沙星、氯霉素。

2.4 综合防治

根据鉴定结果，确定本次发病原因为传染性胸膜肺炎放线杆菌和猪链球菌混合感染，采取了相应的综合防治措施，首先隔离发病猪，彻底消毒，全群添加氟苯尼考和氧氟沙星，发病猪注射头孢噻肟。1周后，病情得到了控制，猪群恢复正常，未再有发病死亡情况。

3 讨论

由于及时快速地确诊了病原，本次疫情很快得到了很好的控制。对于急性发病死亡的情况以及剖检情况我们初步怀疑为传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒其中之一或混合感染。对于后3种病毒病，我们进行了PCR鉴定，均为阴性，排除了病毒病的可能。而从病料中大量分离到传染性胸膜肺炎放线杆菌和猪链球菌，且两种菌的含量高，没有分离到其它病菌，因此本次鉴定的结果是科学可靠的，符合疫情。根据鉴定结果制定的防治措施科学得当，及时控制了疫情，减少了损失。

[1]陈凡．胸膜肺炎放线杆菌血清学分型和基因分型的研究[D]．武汉：华中农业大学，2004．

[2]Schaller A,Djordjevic S P,Eamens G J,et al.Identification and detection of Actinobacillus pleuropneumoniae by PCR based on the gene apxⅣA[J].Vet Microbiol,2001,79(1):47-62.

[3]何孔旺，倪艳秀，王继春，等．猪链球菌分子流行病学[J]．中国人畜共患病杂志，2002，18（5）：45-47．

[4]闫若潜，赵明军，张志凌，等．河南省致病性猪链球菌血清型及耐药性状况调查[J]．河南畜牧兽医（综合版），2007，28（5）：25-27．

[5]Okwumabua O,O'Connor M,Shull E.A polymerase chainreaction (PCR)assay specific for Streptococcus suis based on the gene encoding the glutamate dehydrogenase[J].FEMS Microbiol Lett, 2003,218(1):79-84.

（编辑：柳青）

颈眩汤

组成：赤芍12克，当归10克，熟地黄20克，川芎12克，天麻12克，白术15克，茯苓15克，竹茹10克，丹参20克，甘草3克。

功效：活血养血，祛痰化瘀，通络止眩。

主治：颈椎病眩晕。

用法：煎服，1日1剂，早、中、晚各服1次。

方解：颈椎病眩晕症多见于中老年人，属于中医学眩病范畴。中医学认为，本病是因老年体弱、正气不足、气血亏虚、肝肾不足、久病气血凝滞、夹痰夹瘀、脉络不通而发病。中医学认为无痰不作眩，本病病机为本虚（气血亏虚、肝肾不足）标实（瘀血痰阻）。颈眩汤乃治疗痰瘀致眩之方。方中赤芍和血通络；当归、熟地黄和血养血治头晕目眩；川芎上行头目，以活血祛瘀；天麻平肝息风而止头眩；白术、茯苓健脾燥湿，与天麻配伍共增化痰止眩之功；竹茹祛痰，以竹之脉络通人之脉络也；丹参活血通络祛瘀；甘草调和诸药。诸药共用以达化痰祛瘀止眩、养血通络的功效。

加减运用：伴眠差者加牡蛎、五味子；伴呕吐者加半夏、藿香；伴耳鸣者加柴胡、黄芪、通草；伴面色淡白或萎黄，神疲乏力者加黄芪、太子参、阿胶；伴腰膝酸软，夜尿频多者加芡实、菟丝子、牛膝；伴头目胀痛，急躁易怒者加钩藤、石决明；伴口苦目赤，心烦者加龙胆草、黄芩、栀子。

（摘自《中国中医药报》2016.11.24霍 田/文）

S858.285.1

A

1002-1957(2017)02-0103-02

2017-01-13

河南省科技攻关计划项目（162102110042）；河南省农业科学院自主创新基金项目（2016）

徐引弟（1974-），女，湖北浠水人，副研究员，博士，主要从事动物病原微生物研究.E-mail：445177674@qq.com