木瓜提取物对高糖高脂诱导的小鼠非酒精性脂肪性肝病的影响

吴利春 涂浩 段丽 佘慧宇 张伟 张长城 袁丁 刘朝奇

摘要：目的 观察木瓜提取物对小鼠非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的影响，探讨其可能的分子机制。方法 将40只雄性昆明小鼠随机分成正常组、模型组和药物低（50 mg/kg）、高（100 mg/kg）剂量组。正常组给予普通饲料，其他组给予高糖高脂饲养造模，4周后处死，检测体质量、肝脏质量、血清相关指标及肝脏三酰甘油（TG）水平，HE及油红O染色观察肝脏组织形态，RT-PCR和Western blot检测脂代谢相关基因表达。结果 与正常组比较，模型组小鼠肝脏明显增大，肝指数明显升高（P<0.01），附睾脂肪指数明显升高（P<0.05）；血清丙氨酸氨基转移酶和葡萄糖水平升高（P<0.05）；肝脏TG水平升高（P<0.05）；病理结果显示，肝脏脂肪变性明显；RT-PCR和Western blot结果显示，模型组肝脏组织SIRT1、FoxO1表达水平下调，SERBP-1c表达水平上调。与模型组比较，药物低、高剂量组脂肪肝病理损伤明显改善，肝指数、肝脏TG含量均下降，SIRT1和FoxO1表达水平上调。结论 木瓜提取物对高糖高脂诱导的NAFLD有保护作用，其机制可能是通过SIRT1-FoxO1信号通路发挥作用。

关键词：木瓜提取物；非酒精性脂肪性肝病；脂质代谢；SIRT1信号通路；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.05.012

中图分类號：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）05-0048-04

Effects of Extracted Active Components of Chaenomeles Speciosa on Non-alcoholic Fatty Liver Disease in Model Mice induced by High-fat–high-fructose Diet WU Li-chun1， TU Hao1， DUAN Li1， SHE Hui-yu2， ZHANG Wei1， ZHANG Chang-cheng2， YUAN Ding2， LIU Chao-qi1 （1. Hubei Key Laboratory of Tumor Microenvironment and Immunotherapy， Yichang 443002， China； 2. Medical College， China Three Gorges University， Yichang 443002， China）

Abstract： Objective To study the effects of extracted active components of Chaenomeles Speciosa （EACCS） on non-alcoholic fatty liver disease （NAFLD） in mice； To discuss the possible molecular mechanism. Methods Forty male KM mice were randomized into four groups， namely normal group， model group， low-dose （50 mg/kg） EACCS group and high-dose （100 mg/kg） EACCS group. Except that the normal group was daily given routine diet， the other groups were given high-fat–high-fructose diet （HFFD）. The mice were put to death 4 weeks later. Body weight， liver weight and serum TG were measured. HE and oil red O staining were used to observe liver tissue morphology. RT-PCR and Western blot were used to detect the expression of lipid metabolism related genes. Results Compared with the normal group， the liver size， liver index （P<0.01） and epididymal fat index （P<0.05） increased significantly； The ALT and GLU in serum increased （P<0.05）， TG increased （P<0.05）， and pathological findings showed significant steatosis； RT-PCR and Western blot showed that the expression levels of SIRT1 and FoxO1 mRNA decreased and the level of SERBP-1c increased in the model group. Compared with the model group， the hepatic lipid accumulation of EACCS groups was obviously improved， and the serum ALT， GLU， and TG levels significantly decreased， the expression levels of hepatic SIRT1 and FoxO1 mRNA increased. Conclusion EACCS has protective effects on NAFLD mice induced by HFFD， and its mechanism may be related to the activation of SIRT1-FoxO1 signaling pathway in the liver tissues.

Key words： Chaenomeles Speciosa extracts； non-alcoholic fatty liver disease； lipid metabolism； SIRT1 signaling pathway； mice

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指无饮酒或每周饮酒低于140 g，由其他各种原因导致的肝细胞脂肪变性，三酰甘油（TG）明显升高，进一步发展成脂肪性肝炎、肝纤维化甚至肝癌的一组临床综合征。随着我国居民生活水平不断提高，体力劳动减少，NAFLD发病率逐年上升，大、中城市普通成人的NAFLD发病率高达20%[1]，至今尚无有效的干预措施。因此，急需寻找有效手段防治NAFLD。木瓜是蔷薇科植物贴梗海棠近成熟果实，味酸、性温、归肝脾经，具有祛湿舒筋、平肝和胃的作用[2]。本课题组前期研究发现，木瓜对小鼠NAFLD具有良好的干预作用[3]。为此，本实验对木瓜进行提取分离，进一步研究该药物有效成分对NAFLD的影响及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物及饲料

雄性昆明小鼠40只，SPF级，4～6周龄，体质量18～22 g，三峡大学实验动物中心。饲养于室温20～25 ℃、相对湿度50%～80%、明暗交替12 h/12 h環境，自由摄食饮水，每2 d称重1次。高糖高脂饲料：按照56.5%普通饲料、30%果糖、10%猪油、3%胆固醇、0.5%胆酸钠的比例压制而成。

1.2 药物及制备

将木瓜块粉碎成粗粉后按料液比1∶10加入60%乙醇，浸泡2 h，水浴回流提取3次，每次2 h，过滤。合并3次滤液，减压回收乙醇至无醇味。取木瓜提取液适量，通过大孔树脂进一步分离，应用梯度乙醇作为移动相，收集相应洗脱液，进行浓缩、干燥，获取不同组分木瓜提取物。本实验中应用的是在细胞水平已筛选活性较好的10%乙醇洗脱组分，命名为10%醇木瓜组分，用于后续实验。

1.3 主要试剂与仪器

胆固醇，国药集团化学试剂有限公司；总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒，大连宝生物科技有限公司提供；PCR引物，生工生物工程（上海）股份有限公司合成；兔单抗β-actin（sc-4778），兔多抗FoxO3a（ab1096290），美国Santa Cruz公司；兔多抗SIRT1（#07-131），Millipore公司；羊抗兔二抗，武汉科瑞有限公司提供；显影化学发光剂ECL，碧云天生物技术研究所。Powerpas Basic蛋白电泳仪器，美国伯乐公司；梯度PCR仪，德国Applied Biosysterms公司；Gellogic 200凝胶成像分析系统，美国柯达公司。

1.4 造模

将40只雄性昆明小鼠随机分为正常组、模型组和药物低、高剂量组，每组10只。除正常组给予普通饲料外，其余各组均给予高糖高脂饲料造模，药物低、高剂量组分别给予50、100 mg/kg药物灌胃，正常组和模型组给予生理盐水灌胃。给药体积0.5 mL/d，连续4周。

1.5 血清及肝脏生化指标测定

小鼠脱颈椎处死，眼球取血，室温静置30 min，3000 r/min离心10 min后取血清，按葡萄糖（GLU）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）检测试剂盒说明书进行检测。称取100 mg肝脏组织，加入900 μL 95%异丙醇于冰上研磨，室温静置2 h，4 ℃、2000 r/min离心4 min，取上清液，并按试剂盒说明书检测TG含量。

1.6 肝指数及附睾脂肪指数测定

处死小鼠前称重，处死后完整取下肝脏及附睾脂肪组织，分别称重，计算肝指数（肝脏质量÷体质量）和附睾脂肪指数（附睾脂肪质量÷体质量）。

1.7 肝组织HE和油红O染色

取10 mm×3 mm新鲜肝脏大叶放入包埋盒中，于10%中性甲醛溶液中固定24 h，用水清洗后经梯度乙醇脱水，石蜡包埋切片（厚度4 μm），HE染色，显微镜下观察肝细胞结构及病理变化。取新鲜肝脏作冰冻切片，油红O染色，显微镜下观察肝细胞脂肪变性情况。

1.8 RT-PCR检测肝组织mRNA表达

应用试剂盒提取总RNA，测定浓度，通过电泳观察RNA的完整性。按照反转录试剂盒说明书操作获得cDNA，并进行PCR扩增。引物序列见表1。PCR反应体系总体积为25 ?L：10.5 ?L DEPC水，12.5 ?L PCR Master mix（2×），加入SIRT1、FoxO1、SREBP、GAPDH引物上下游各0.5 ?L，最后加入cDNA模板1 ?L。使用GAPDH作为内参。产物经2%琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶成像分析系统测定灰度平均值，以样品各基因的灰度值与其内参照GAPDH的比值代表其mRNA相对量。

1.9 Western blot检测肝组织蛋白表达

称取50～100 mg肝脏组织匀浆后，加入蛋白裂解液提取总蛋白。95 ℃变性5～10 min，SDS-PAGE电泳和转膜，再5%牛奶封闭，4 ℃一抗孵育过夜，二抗室温孵育1 h，ECL显色。应用Image J软件进行灰度扫描分析，以样品各基因的灰度值与其内参照β-actin的比值代表蛋白相对表达量。

1.10 统计学方法

采用SPSS18.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 木瓜提取物对模型小鼠相关指标的影响

与正常组比较，模型组肝脏指数、附睾脂肪指数、肝脏TG含量及血清GLU、ALT水平明显升高（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，药物各剂量组均有不同程度改善，其中药物高剂量组肝脏指数、附睾脂肪指数及血清ALT、GLU水平明显降低（P<0.05，P<0.01），药物低剂量组肝脏TG含量明显降低（P<0.05）。结果见表2。