蛇床子素固体脂质纳米粒的体内抗肿瘤活性研究

陈娇婷　叶民珠

[摘要]目的：制备蛇床子素固体脂质纳米粒（ost-SLN），并考察ost-SLN体内的抗肿瘤活性。方法：采用熔融-匀化法制备蛇床子素固体脂质纳米粒，评价Ost-SLN对小鼠H22肝癌实体瘤的抑瘤作用，观察对脾、胸腺等器官的损伤情况，比较不同浓度下对机体带来的影响。结果：ost-SLN可不同程度地抑制H22荷瘤小鼠的肿瘤生长，而且随着给药浓度增加，ost-SLN的抑瘤率均上升，分别为34.2%、50.9%、68.5%。结论：ost-SLN在体内均有明显的抗肿瘤活性，且未出现毒性反应，有望开发成一种高效、低毒的蛇床子素制剂。

[关键词]蛇床子素；ost-SLN；抗肿瘤

蛇床子素（osthol，osc）是从伞形科植物蛇床的果实中提取分离得到的一种香豆素类化合物，其核心结构由苯环和吡喃酮环组成。药理研究表明，蛇床子素对心血管系统、中枢神经系统、免疫系统等有重要活性，且在抗肿瘤、抗骨质疏松症及抗变态反应等方面也均有较强的效果。但由于蛇床子素在水中难溶，口服吸收差，生物利用度低，个体差异大，限制了其在临床上的广泛应用。研究采用熔融-匀化法制备蛇床子素固体脂质纳米粒，建立小鼠H22肝癌实体瘤模型，评价蛇床子素固体脂质纳米粒对小鼠H22肝癌实体瘤的抑瘤作用，观察对脾、胸腺等器官的损伤情况，比较其不同浓度下对机体带来的影响和可能产生的毒副作用，为蛇床子素固体脂质纳米粒的进一步临床研究奠定基础。

1.仪器与材料

1.1仪器 Sartorius ALC4100电子天平（广州市上博电子科技有限公司）；85-2型数显恒温磁力搅拌器（巩义市科瑞仪器有限公司）；NIROSOAVI高压乳匀机（美国仪器集团）；高效液相色谱仪（日本岛津）；高分辨透射电镜（81W/AIS2100，西化仪器有限公司）。

1.2试药 蛇床子素（批号：110822-200406，南京替斯艾么中药研究所）；单硬脂酸甘油酯（批号：054K5303，上海凌峰化学试剂有限公司）；大豆卵磷脂（批号：2075523，上海爱康精细化工有限公司）；泊洛沙姆188（批号：WPWA544C，南京威尔化工有限公司）；无水乙醇（批号：20110528，上海化学试剂有限公司）；甲醇（色谱纯，山东浩中化工科技有限公司），其余试剂均为分析纯。

1.3动物与瘤株 昆明种小鼠，体重18～22g，雌雄各半，清洁级，动物合格证号：JxA2005318，由赣南医学院实验动物中心提供。肝癌细胞H22由赣南医学院药理实验室提供。

2.方法

2.1蛇床子素固体脂质纳米粒的制备 采用熔融-匀化法制备，称取处方量的单硬脂酸甘油酯在（75±2）℃加热熔融后，蛇床子素用适量无水乙醇溶解后，两者均匀混合作为油相。取处方量的大豆卵磷脂、泊洛沙姆188、水在超声中溶解，并加热至（75±2）℃成为水相。在搅拌下将水相缓慢滴加到油相中，制成O/W型初乳。用高压乳均机在100 MPa压强下，于（75±2）℃下反复乳匀5次后，迅速冷却形成蛇床子素固体脂质纳米粒混悬液。

2.2纳米粒的质量评价

2.2.1ost—SLN的形态学观察及粒径分布形态学观察 按照最佳方案制备的ost-SLN，采用电子显微镜观察。将ost-SLN样品，用水稀释至适当浓度，用激光散射粒度测定仪测定其粒径。

2.2.2包封率的测定 采用超速离心法，精密量取蛇床子素固体脂质纳米粒1mL，置离心管，于10000r/min离心30min。取上清液用甲醇定容于10mL量瓶，经孔径0.45um微孔滤膜滤过，备用。在此色谱条件（色谱柱：C18柱；检测波长：322nm；流动相：甲醇-水（75：25）；柱温：室温；流速1mL/min）测定游离药物浓度。

精密量取蛇床子素固体脂质纳米粒lmL，置10mL量瓶，用甲醇定容，超声处理，静置，经孔径0.45um微孔滤膜滤过，备用。采用上述色谱条件测定蛇床子素固体脂质纳米粒中总药量，并根据公式计算包封率。包封率（%）=[（总药量-游离药物量）/总药量]×100%。

2.3体内抗肿瘤活性研究

2.3.1小鼠肝癌细胞H22荷瘤小鼠模型制备 H22瘤株经小鼠腹腔7d传代1次，取第3代用于实验，腹水瘤小鼠脱颈椎处死，无菌条件下用一次性无菌注射器抽取乳白色腹水，置于已灭菌的离心管中，细胞计数器计数，用无菌生理盐水稀释成1×10个/mL的肿瘤细胞悬液，接种于小鼠右前肢腋部皮下，每只0.2mL。

2.3.2Hz2肝癌小鼠分组及给药 接种次日随机分组，每组10只，雌雄各半。分组后立即腹腔注射给药，药量经预实验确定，每天用藥1次，连续8d。分组及给药量分别为：模型组为生理盐水，对照组环磷酰胺组（20mg/Kg），分别用Ost、Ost-SLN的低、中、高剂量组为用药组。药物3个剂量组为1.0、2.0、4.0mg/Kg，每只给药0.2mL/d。

2.3.3检测指标末次给药后24h（禁食不禁水），后颈椎脱臼处死各组小鼠，完整剥离肿瘤并称重，计算抑瘤率。剖取胸腺和脾脏，计算脏器指数。

抑瘤率=（模型组平均瘤质量-用药组平均瘤重）/模型组平均瘤质量×100%。

脾脏或胸腺指数/mg/g=脾脏或胸腺重量/体重。

2.4统计学方法 采用统计学软件SPSS 13.0进行数据分析。计量资料以均数加减标准差（x±s）表示，行t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

3.结果

3.1纳米粒的质量评价 在电子显微镜照片中显示，ost-SLN大都呈规则、完整的圆形或卵圆形，粒子分散状态良好，无粘连。形态学图见图1。平均粒径分布范围为100～200nm，分布比较均匀。粒径分布图见图2。测得其包封率为59.78%。

3.2体内抗肿瘤活性研究

3.2.1小鼠瘤重的影响 ost-SLN用药组对H22荷瘤小鼠的肿瘤抑制率达到了34.2%，与模型组比较抑瘤效果有统计学差异（P<0.05）。随着给药浓度增加，药物的抑瘤率均上升，分别为34.2%、50.9%、68.5%。ost-SLN可以增强ost对小鼠肿瘤的抑制作用，反映了其在体内良好的靶向分布和抗肿瘤活性。见表1。

3.2.2胸腺指数和脾指数比较 各组小鼠处死时体重变化与对照组比较，发现用药组中不同剂量可见ost-SLN组对小鼠体重的抑制作用较小，这应当与其在体内的靶向性分布，减少药物在其它组织和细胞中的分布有关。用药组中荷瘤小鼠的胸腺指数和脾指数都比模型组的免疫指数略大一些。见表2。

4.讨论

实验中采用熔融一匀化法制备ost-SLN样品，将载药类脂熔融物分散于热的乳化剂水溶液中形成初乳，初乳经高压乳均机匀质形成纳米乳，室温下冷却固化形成SLN。该法得到的SLN粒径小且分布窄，但高温会增加药物和载体的降解速度。为进一步考察蛇床子素的抑瘤活性，实验进行了蛇床子素对荷瘤小鼠抑瘤活性的研究和对脾、胸腺等器官损伤情况的考察，观察其给药剂量下对机体带来的影响和可能产生的毒副作用，以揭示其在临床肿瘤治疗中潜在的应用前景。

实验结果显示，环磷酰胺和ost-SLN可不同程度地抑制H22荷瘤小鼠的肿瘤生长，其中随着给药浓度增加，ost-SLN的抑瘤率均上升，分别为34.2%、50.9%、68.5%。表明其在体内良好的靶向分布和抗肿瘤活性；且高浓度的ost-SLN的抑瘤率比环磷酰胺更好；胸腺指数和脾指数结果表明，用药组中荷瘤小鼠的胸腺指数和脾指数都比模型组的免疫指数略大一些，可能是接种肿瘤后刺激了免疫系统，也可能是吞噬作用或病理性增大。