miR-124对非小细胞肺癌细胞增殖的影响及其机制

宁卫卫 曾园园 朱健洁 刘泽毅 郭圆圆 黄建安

·基础研究·

miR-124对非小细胞肺癌细胞增殖的影响及其机制

宁卫卫 曾园园 朱健洁 刘泽毅 郭圆圆 黄建安

目的 探讨miR-124对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖的影响及其机制。方法 采用CCK8法和克隆形成实验评估miR-124对细胞增殖能力的影响。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot检测miR-124转染后细胞内PIM3的表达水平。通过双荧光素酶报告系统检测miR-124对PIM3荧光素酶活性的影响，证实miR-124可靶向作用于PIM3的3’UTR区。采用qRT-PCR和Western blot检测si-PIM3转染后细胞内PIM3的表达情况，采用CCK8法和克隆形成实验检测沉默PIM3后对细胞增殖能力的影响。结果 ①miR-124模拟物组的细胞活性(OD值)低于其对照组，差异有统计学意义，且呈时间依赖性；miR-124模拟物组的克隆形成数明显少于其对照组。②miR-124模拟物组的miR-124过表达后，其PIM3表达低于其对照组，差异有统计学意义。③含野生型结合位点(PIM3 3’UTR区完整片段)的miR-124模拟物组的荧光素酶活性低于其对照组，差异有统计学意义；含突变型结合位点(PIM3 3’UTR区突变片段)的两组无明显差异。④si-PIM3组的PIM3被沉默后，其表达水平明显低于其对照组，差异有统计学意义；si-PIM3组的细胞活性(OD值)低于其对照组，差异有统计学意义，且呈时间依赖性；si-PIM3组的克隆形成数明显少于其对照组。结论 miR-124可通过靶向作用于PIM3的3’UTR区下调后者的表达而抑制NSCLC细胞的增殖。

非小细胞肺癌；miR-124；PIM3；细胞增殖

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:697～701)

MicroRNAs (miRNAs)是1类长约20～25 bp的非编码RNA，其可通过与下游靶基因的mRNA进行碱基互补配对，而从转录后水平影响靶基因表达。现已证实，miRNA与肿瘤的发生发展关系密切。其中，miR-124被认为在多种实体肿瘤的发生发展过程中担任着“抑癌基因”的角色。例如miR-124可抑制肿瘤细胞的增殖[1-2]，促进肿瘤细胞的凋亡[3-4]，以及抑制肿瘤细胞的侵袭和转移等[5-8]。本研究中，我们通过TargetScan 6.2在线软件预选出PIM3作为miR-124的靶基因之一，并通过双荧光报告载体系统和细胞实验证实了miR-124对PIM3的作用机制以及对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人NSCLC细胞株A549购买自中国科学院上海细胞研究所。细胞培养在含10 %胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺和抗生素的RPMI-1640 medium(购自美国HyClone公司)中，置于37 ℃含5 %CO2的细胞培养箱中。

1.2 RNA提取，cDNA合成及实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

用RNAiso Plus试剂盒(购自日本TaKaRa公司)提取所培养细胞的总RNA。用Reverse Transcriptase M-MLV试剂盒(购自日本TaKaRa公司)进行逆转录合成cDNA。用于qRT-PCR的miR-124的引物序列由广州锐博公司合成；PIM3引物序列如下：正向5’-AAGCTCATCGACTTCGGTTC-3’，反向5’-GAGGATCTCCTCGTCCTGCT-3’；GAPDH引物序列如下：正向：5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’，反向：5’-GGCATGGACTGTGGTCATGG-3’。 用SYBR Premix ExTaqTM试剂(购自日本TaKaRa公司)，基于ABI StepOne Plus Real-Time PCR系统(购自美国Applied Biosystems公司)进行qRT-PCR反应。反应程序如下：50 ℃，2 min；预变性95 ℃，10 min；然后变性95 ℃，15 s；退火延伸60 ℃，1 min；一共进行40次循环。每次在延伸阶段读取荧光值。PIM3和miR-124的mRNA值分别以内参GAPDH和U6作为标准化参照，其相对表达量用2-ΔΔCt(Ct代表循环阈值)值计算表示。

1.3 构建PIM3 3’UTR-荧光素酶报告载体，瞬时转染和荧光检测

我们先用TargetScan 6.2在线软件预选出PIM3基因3’UTR区内可以与miR-124相结合的一片段，然后将该段序列以原序列或将其突变的方式进行合成延伸，最后亚克隆到psiCHECK2载体中。用miR-124模拟物(购自上海吉玛公司)、miR-NC(购自购自上海吉玛公司)和Lipofectamine 2000(购自美国Invitrogen公司)瞬时转染A549细胞株48 h后，收集细胞。用购自美国Dual-Luciferase Report Assay试剂盒检测荧光素酶活性。

1.4 细胞增殖检测

瞬时转染48h后，将A549细胞株接种到96孔板中(2×103个细胞/孔)，每组设3个平行复孔，并设置调零孔(不接种细胞，仅加入RPMI 1640培养基)。用Cell Counting Kit-8 检测试剂盒(购自中国武汉博士德公司)分别检测接种24 h、48 h和96 h后的细胞活性。检测时每孔加10 μl CCK8检测试剂，于37 ℃孵育4 h后，用酶标仪测定450 nm波长的吸光度值(OD值)。

1.5 细胞裂解和Western-Blot实验

当A549细胞在细胞培养瓶中长到80 %～90 %时，用RIPA buffer(购自美国Cell Signaling Technology公司)和蛋白酶抑制剂以及磷酸酶抑制剂(购自美国Sigma公司)裂解细胞，收获蛋白质。 SDS-PAGE电泳分离蛋白质；蛋白质转移到硝酸纤维素膜上；免疫反应(一抗、二抗孵育)；化学发光(ECL试剂盒)；显影和定影。一抗浓度(抗β-actin单抗为1∶3000，抗PIM3多抗为1∶1000)，二抗浓度(山羊抗鼠为1∶2000，山羊抗兔为1∶2000)。ECL试剂盒购自美国Thermo Scientific公司；一抗(抗PIM3多体、抗β-actin单体)和辣根过氧化物酶标记的二抗(山羊抗鼠、山羊抗兔)均购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 miR-124对NSCLC细胞增殖的影响

将miR-124及其对照模拟物瞬时转染A549细胞株后，采用qRT-PCR和CCK8法检测，结果显示miR-124过表达(图1A)可以明显抑制细胞增殖，且呈时间依赖性(图1B)。克隆形成实验也证实了这一点(图1C)。

2.2 miR-124直接作用于PIM3的3’UTR下调其的表达

用TargetScan 6.2在线软件预测并选出PIM3可能是miR-124调控的下游靶基因之一，然后通过细胞转染实验发现，miR-124的过度表达可明显抑制肿瘤细胞内PIM3的表达。为了探讨miR-124对PIM3的作用机制，用miR-124结合位点的PIM3 3’UTR片段的原序列(野生型)和突变序列(突变型)分别亚克隆到psiCHECK2双荧光载体中，将由此得到的重组载体与miR-124模拟物或其对照模拟物共同瞬时转染到A549细胞株中。后续的荧光素酶活性检测结果显示，具有野生型结合位点的miR-124模拟物组的荧光素酶活性较对照组明显减弱，而突变型结合位点的miR-124模拟物组与对照组的荧光素酶活性无明显差异，表明miR-124可以直接特异性地结合到PIM3的3’UTR区。因此，这些结果强有力地证明了miR-124可通过直接作用于PIM3的3’UTR区而下调后者的表达。

2.3 miR-124和PIM3对NSCLC细胞增殖的影响

将si-PIM3及其对照模拟物瞬时转染A549细胞株后，采用CCK8法检测，结果显示PIM3被沉默后(图2 A,B)，肿瘤细胞的增殖能力均明显减弱，且呈时间依赖性(图2C)。类似的结果也出现在miR-124及其对照组模拟物转染细胞后的CCK8检测结果(图1B)及克隆形成实验的结果中(图1C,2D)。综上，推断miR-124可通过削弱PIM3的“促癌”作用而抑制NSCLC细胞增殖。

A为qRT-PCR检测；B为CCK-8检测；C为克隆形成实验。

3 讨论

非小细胞肺癌(NSCLC)是目前世界上最常见的肺癌类型(>80 %)，其传统治疗手段包括手术、放疗、化疗，但其5年中位生存率仍然仅为10 %左右[9]。近年来，分子靶向治疗已成为非小细胞肺癌最热门也最具前景的研究领域，其相关驱动基因包括EGFR、KRAS、ELM4-ALK、cMET、ROS1、RET等。但是此类患者往往需承担更加高昂的药物费用，且大多也会在一到两年内因出现耐药而“无药可医”。因此，探索非小细胞肺癌的发病机制及寻找新的诊断和治疗方向很有必要。MicroRNAs(miRNAs)是真核生物体内一类长约20～25个核苷酸的内源性非编码RNA。成熟的miRNAs可通过与其下游靶基因的mRNA进行碱基互补配对，从而使后者发生降解、影响其稳定性或抑制其表达。1种miRNA可有多个靶基因，而多种miRNA也可作用于同1个靶基因。其中，miR-124是一类在哺乳动物神经系统表达含量最丰富的miRNA，在原肠胚形成和神经发育过程中发挥重要作用。多项研究证实，miR-124多种类型实体肿瘤中低表达，如结肠癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌等[1-2,4]。近期，Yayun Zhang等[10]和Xie Chao等[11]研究结果显示miR-124在NSCLC组织和细胞株中低表达，且与NSCLC转移和预后密切相关。同时，后者的进一步研究表明miR-124可直接与其下游靶基因SOX8 mRNA的3’UTR结合，从而抑制NSCLC细胞增殖。Li XiuMei等[12]研究表明，miR-124可通过靶向作用于STAT3而抑制NSCLC细胞增殖，并可作为术后患者的一项预后指标。Yingjia Sun等[13]证实NF-κB介导的miR-124在淋巴结转移的NSCLC中低表达；而miR-124可通过靶向作用于MYO10，抑制NSCLC细胞的侵袭和转移。另外，Lidong Zu等[14]发现miR-124和TGF-β信号通路之间存在的反馈回路可能参与NSCLC的转移过程。因此，与其他类型肿瘤一样，miR-124在NSCLC中呈低表达，其可通过作用于其下游的多种靶基因抑制肿瘤细胞增殖，并可作为NSCLC靶向治疗和判断预后的一项潜在指标。

A、B分别为qRT-PCR和Western blot检测；C、D分别为 CCK8法和克隆形成实验。

本研究中，我们通过TargetScan 6.2在线软件预测并选出PIM3作为miR-124的下游靶基因之一。PIM3是原癌基因PIM3家族的新成员，与其余两个成员PIM1和PIM2有着高度同源的基因序列。因此PIM家族的生物学特性很相似，均可以表达丝/苏氨酸激酶活性，磷酸化多种特异性底物，调控细胞周期和凋亡。目前认为PIM3发挥生物学功能主要有以下几个途径：通过磷酸化Bad或上调Bcl-2表达，抑制细胞凋亡；磷酸化P27、P21、Cdc25A、Cdc25C、C-TAK1等，加速细胞周期进程；通过调控AMPK、c-Myc和PGC-α或磷酸化EIF4B，提高蛋白合成；通过SOCS6抑制Erk1/2，从而抑制胰岛素分泌；调控内皮细胞扩散、迁移和增殖以及胚胎干细胞的自我更新；调节Myc的转录活性等[15]。因此，PIM3的异常表达势必参与肿瘤的发生发展，如促进肿瘤增殖、侵袭和转移，抑制肿瘤细胞凋亡及诱导肿瘤血管生成等[16]。现已证实，PIM3在多种肿瘤，尤其是在内胚层衍生器官发生的肿瘤中异常高表达，如肝癌、胰腺癌和结肠癌等。然而，PIM3与肺癌的相关性研究鲜有报道。罗强等[17]和倪志强等[18]研究发现PIM3在体外肺癌细胞系和术后肺癌组织中的表达明显高于癌旁组织和正常组织，且与肿瘤分化程度和淋巴结转移密切相关，而与肺癌类型等其他临床病理特征无关。同时后者还发现PIM3可能参与抑制非小细胞肺癌细胞凋亡；何凌云等[19]认为PIM3和Cdk-2可协同高表达参与肺鳞癌的发生发展过程。

另外，近期有学者用双荧光素酶报告系统筛选出miR-15a/b、miR-16、miR-33a/b、miR-124、miR-195和miR-506能通过直接靶向作用于PIM3的3’UTR而抑制其荧光素酶活性，同时通过细胞实验证实miR-506可下调PIM3表达而抑制胰腺癌细胞增殖[20]。本研究中，我们用TargetScan 6.2在线软件和双荧光素酶报告系统预选和证实了PIM3也是miR-124的下游靶基因之一，且首次证实在NSCLC细胞中，miR-124可通过下调PIM3表达而抑制肿瘤细胞增殖。因此，如果能进一步通过动物实验和临床试验证实，miR-124很可能成为治疗NSCLC的新靶点之一。然而，不同miRNA与多种靶基因形成的调控网络极其庞大和复杂，且它们在不同肿瘤中的作用亦可有差别，因此miR-124及其靶基因在NSCLC中的作用机制和潜在价值仍需进一步研究和探索。

[1] Zhang J,Lu Y,Yue X,et al.MiR-124 suppresses growth of human colorectal cancer by inhibiting STAT3〔J〕.PLoS One,2013,8(8):e70300.

[2] Feng T,Xu D,Tu C,et al.MiR-124 inhibits cell proliferation in breast cancer through downregulation of CDK4〔J〕.Tumour Biol,2015,36(8):5987-5997.

[3] Li Y,Zhang Z,Liu X,et al.miR-124 functions as a tumor suppressor in the endometrial carcinoma cell line HEC-1B partly by suppressing STAT3〔J〕.Mol Cell Biochem,2014,388(1-2):219-231.

[4] Geng S,Zhang X,Chen J,et al.The tumor suppressor role of miR-124 in osteosarcoma〔J〕.PLoS One,2014,9(6):e91566.

[5] Xu X,Li S,Lin Y,et al.MicroRNA-124-3p inhibits cell migration and invasion in bladder cancer cells by targeting ROCK1〔J〕.J Transl Med,2013,11(1):276.

[6] Liang YJ,Wang QY,Zhou CX,et al.MiR-124 targets Slug to regulate epithelial-mesenchymal transition and metastasis of breast cancer〔J〕.Carcinogenesis,2013,34(3):713-722.

[7] Hu CB,Li QL,Hu JF,et al.miR-124 inhibits growth and invasion of gastric cancer by targeting ROCK1〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev,2014,15(16):6543-6.

[8] Sun Y,Ai X,Shen S,et al.NF-kappaB-mediated miR-124 suppresses metastasis of non-small-cell lung cancer by targeting MYO10〔J〕.Oncotarget,2015,6(10):8244-54.

[9] Malvezzi M,Bertuccio P,Levi F,et al.European cancer mortality predictions for the year 2012〔J〕.Ann Oncol,2012,23(4):1044-1052.

[10] Zhang Y,Li H,Han J.Down-regulation of microRNA-124 is correlated with tumor metastasis and poor prognosis in patients with lung cancer〔J〕.Int J Clin Exp Pathol,2015,8(2):1967-1972.

[11] Xie C,Han Y,Liu Y,et al.miRNA-124 down-regulates SOX8 expression and suppresses cell proliferation in non-small cell lung cancer〔J〕.Int J Clin Exp Pathol,2014,7(11):7518-7526.

[12] Li X,Yu Z,Li Y,et al.The tumor suppressor miR-124 inhibits cell proliferation by targeting STAT3 and functions as a prognostic marker for postoperative NSCLC patients〔J〕.Int J Oncol,2015,46(2):798-808.

[13] Sun Y,Ai X,Shen S,et al.NF-kappaB-mediated miR-124 suppresses metastasis of non-small-cell lung cancer by targeting MYO10〔J〕.Oncotarget,2015,6(10):8244-8254.

[14] Zu L,Xue Y,Wang J,et al.The feedback loop between miR-124 and TGF-beta pathway plays a significant role in non-small cell lung cancer metastasis〔J〕.Carcinogenesis,2016,37(3):333-343.

[15] Li YY,Mukaida N.Pathophysiological roles of Pim-3 kinase in pancreatic cancer development and progression〔J〕.World J Gastroenterol,2014,20(28):9392-9404.

[16] Yang H,Wang Y,Qian H,et al.Pim protein kinase-3 is regulated by TNF-alpha and promotes endothelial cell sprouting〔J〕.Mol Cells,2011,32(3):235-241.

[17] 罗 强,熊 畅,熊 珊,等.Pim-3在肺癌组织中的表达〔J〕.华南国防医学杂志,2012,26 (1)：16-18.

[18] 倪志强,方艳秋,谭 岩,等.Pim-3在非小细胞肺癌中的表达及临床意义探讨〔J〕.当代医学,2012,18 (36):24-25.

[19] 何凌云,黄健辉,刘永春,等.Pim-3、Cdk-2蛋白在肺鳞癌中的表达及其意义〔J〕.咸宁学院学报,2012,26 (2):104-107.

[20] Du J,Zheng X,Cai S,et al.MicroRNA506 participates in pancreatic cancer pathogenesis by targeting PIM3〔J〕.Mol Med Rep,2015,12(4):5121-5126.

(编辑：吴小红)

Effect of miR-124 on Cell Proliferation of Non-small Cell Lung Cancer and ItsMechanism

NINGWeiwei,ZENGYuanyuan,ZHUJianjie,etal.

TheFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou,215006

Objective To study the effectof miRNA-124 on cell proliferation of non-small cell lung cancer(NSCLC) and its mechanism.Methods The CCK8 assay and colony formation assay were employed to evaluate the impact of miR-124 on cell proliferation.Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and western-blot were used to detect PIM3 expression in the cells transfected with miR-124.The dual luciferase reportor gene assay was performed to detect the influence of miR-124 upon PIM3 luciferase activity,which demonstrated that miR-124 specifically could bind to PIM3 3’UTR.The PIM3 expression in the cells transfected with si-PIM3 was detected with qRT-PCR and western-blot,while effect of PIM3 silencing on cell proliferation was assessed by CCK-8 assay and colony formation assay.Results ①The cell viability (OD value) in miR-124 mimics group was lower than the control group,with statistically significant difference,and in a time-dependent manner.The colony-forming populations of cultural cells in miR-124 mimics group were significantly less than the control group.②PIM3 expression of cells in miR-124 mimics group was lower than the control group,with statistically significant difference,after overexpression of miR-124 in the experimental group.③The luciferase activity of PIM3 with intact 3’UTR region (wildt-ype) in miR-124 mimics group was lower than the control group,and the difference was statistically significant.While no difference was shown in the luciferase activity of PIM3 with mutant 3’UTR region (mutant-type) between the experimental group and the control group.④PIM3 expression of cells in si-PIM3 group (kockdown group) and si-NC group were statistically different.The cell viability (OD value) in si-PIM3 group was lower than the control group,with statistically significant difference,in a time-dependent manner.And the colony-forming populations of cultural cells in si-PIM3 group were extremely less than the control group.Conclusion miR-124 can directly bind to 3’UTR of PIM3,thus reducing PIM3 expression to inhibit proliferation of NSCLC cells.

Non-small cell lung cancer(NSCLC);miR-124;PIM3;Cell proliferation

国家自然科学基金(编号：31270940)，苏州市临床医学中心(编号：Szzx201502)

215006 苏州大学附属第一医院(宁卫卫，曾园园，朱健洁，刘泽毅，郭圆圆，黄建安)；215006 苏州大学呼吸疾病研究所(曾园园，朱健洁，刘泽毅，黄建安)

黄建安

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.05.001

R734.2

A

1001-5930(2017)05-0697-05

2016-04-11

2017-03-28)