加味丹参饮含药血清预处理对缺氧/复氧H9C2心肌细胞自噬相关基因Atg5和Beclin1 mRNA表达的影响

饶春梅 成细华 任 婷 孙彦波 彭 霞 黄政德

(湖南中医药大学，湖南 长沙 410208)

·基础研究·

加味丹参饮含药血清预处理对缺氧/复氧H9C2心肌细胞自噬相关基因Atg5和Beclin1 mRNA表达的影响

饶春梅 成细华 任 婷 孙彦波 彭 霞 黄政德

(湖南中医药大学，湖南 长沙 410208)

目的 探讨加味丹参饮含药血清预处理对缺氧/复氧H9C2心肌细胞自噬及其相关基因Atg5、Beclin1 mRNA表达的影响。方法 将体外培养的H9C2心肌细胞随机分为空白血清组(CG)、缺氧/复氧组(HRG)、加味丹参饮含药血清组(JDG)、JDG+自噬抑制剂(3-MA)组(JIG)、JDG+自噬激动剂(RAPA)组(JAG)。倒置显微镜观察各组心肌细胞生长及形态变化；MTT比色法测定心肌细胞存活率；透射电子显微镜观察心肌细胞自噬体形态及数量；实时荧光定量PCR检测自噬相关基因Atg5、Beclin1 mRNA表达。结果 与CG比较，HRG镜下心肌细胞变性坏死程度增加，细胞存活率下降(P<0.01)，电镜下自噬体增多，实时荧光定量PCR示Atg5、Beclin1 mRNA表达上调；与HRG相比，JDG及JAG镜下心肌细胞变性坏死程度减轻，细胞存活率显著升高(P<0.01)，电镜下自噬体增加，Atg5、Beclin1 mRNA表达进一步上调(P<0.05)。结论 加味丹参饮预处理通过上调自噬相关基因Atg5、Beclin1 mRNA表达，增强细胞自噬，保护缺氧/复氧损伤H9C2心肌细胞。

加味丹参饮含药血清；H9C2心肌细胞；缺氧/复氧损伤；自噬；Atg5 mRNA；Beclin1 mRNA

随着静脉溶栓、经皮冠状动脉腔内成形术等方法治疗急性心肌梗死的广泛开展，急性心肌梗死患者的预后得到明显改善。但是随之而来的心肌缺血再灌注(IR)损伤却严重制约着上述方法的救治成功率，因此，心肌IR损伤机制及心肌保护的研究一直是当今研究热点之一。自噬对维持正常心脏形态和心肌功能起到重要作用，在心肌IR损伤过程中扮演重要角色〔1〕。益气活血中药复方加味丹参饮对IR损伤心肌细胞具有保护作用，通过抗氧化、抗炎症、抗凋亡等途径抗心肌细胞损伤〔2～4〕。本研究在此基础上观察加味丹参饮含药血清预处理对缺氧/复氧H9C2心肌细胞自噬及其相关基因Atg5、Beclin1 mRNA表达的影响，进一步探讨该方抗心肌细胞IR损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株和实验动物 H9C2(2-1)大鼠心肌细胞株购自中国科学院上海细胞库。清洁级雄性SD大鼠40只，体质量250～280 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SYXK(湘)2013-0005，饲养于湖南中医药大学SPF级实验动物中心，用于制备动物血清。

1.2 药物 加味丹参饮中药购自湖南中医药大学附属第一医院中药房。水煎2次，合并煎液，过滤浓缩至2 g生药/ml，置于4℃冰箱备用。

1.3 主要试剂与仪器 3-甲基腺嘌呤(3-MA,S24823-1g 上海源叶),雷帕霉素(Rapamycin，S17098-100 mg 上海源叶)。高糖(4.5 g/L)DMEM(SH30022.01，Hyclone)，胎牛血清(blz-000211,GIBCO)，0.25%胰酶-EDTA(blz-0193，GIBCO)，青链霉素混合液(10378，GIBCO)，DMSO(D2650，Sigma)，MTT(MT120C，Spectrum)，PBS(blz-0099，Solarbio)，qRT-PCR引物由上海生工生物技术有限公司提供。Trizol(Sigma)，mRNA逆转录试剂盒(Takara)，SYBR Premix Ex Taq(Takara)，CO2细胞培养箱(HF160W,力康)，超净工作台(JB-CJ-2B，常州普天仪器)，倒置显微镜(XD-202，上海)，酶标仪(BioTek,美国)，PCR仪(2400 PCR System,perkin Elmer)，Real-time PCR仪(7900 HT System,ABI),台式低速微量离心机(Eppendorf)，日立H7700透射电镜。

1.4 加味丹参饮含药血清制备 40只SD大鼠随机分为空白血清组和含药血清组，每组20只。加味丹参饮按临床体表面积换算，相当于人临床用药剂量的8倍〔5〕。含药血清组大鼠以生药59.28 g/kg、2次/d灌胃，连续7 d；空白血清组给予等体积蒸馏水灌胃。于末次给药后1 h,无菌条件下，腹主动脉插管取血，室温静置2 h，3 000 r/min离心10 min，取上清。56℃灭活30 min，0.22 μm滤膜过滤除菌,分装,-20℃冰箱保存备用。使用前用DMEM培养基稀释成体积分数含药血清。

1.5 H9C2(2-1)大鼠心肌细胞培养与传代 将H9C2(2-1)大鼠心肌细胞用培养液(90%高糖DMEM液+10%胎牛血清+1% 青链霉素)在37℃、5%CO2恒温培养箱中培养，24 h更换培养液，待细胞汇合率达80%时用0.25% 胰蛋白酶消化收集细胞并传代。

1.6 缺氧/复氧细胞模型的建立 参照《药理实验方法学》〔6〕和本课题组建立的模型进行实验〔7〕。DMEM培养液用高纯氮气饱和30 min，使培养液氧分压低于4.0 kPa(30 mmHg)，得缺氧培养液。心肌细胞单层换用缺氧培养液后，培养液内立即充入氮气(1 L/min流量)30 s以驱除瓶内氧气，然后塞紧瓶塞密闭培养。缺氧不同时间后可造成心肌细胞不同程度的损害。按此方法造成心肌细胞缺氧，缺氧2 h后换用正常培养液培养3 h，造成再给氧损伤。

1.7 分组及给药 取对数生长期H9C2心肌细胞，随机分为5组，每组6孔，①空白血清组(CG)：在含15%空白血清培养液中常规培养29 h；②缺氧/复氧组(HRG)：在含15%空白血清培养液中常规培养24 h，更换缺氧培养液，缺氧2 h，再给氧3 h；③加味丹参饮含药血清组(JDG)：在含15%药物血清中常规培养24 h，缺氧2 h，再给氧3 h；④ JDG+自噬抑制剂(3-MA)组(JIG)：3-甲基腺嘌呤(10 mmol/L)预处理30 min，余同③；⑤JDG+自噬激动剂(RAPA)组(JAG)：雷帕霉素(100 nmol/L)预处理30 min，余同③。

1.8 MTT法测定不同浓度含药血清对H9C2心肌细胞存活率的影响 取对数生长期H9C2(2-1)心肌细胞制成单细胞悬液后，以5×104个/ml密度接种于96孔板，每孔100 μl，贴壁后换为6个不同浓度含药血清(5%、10%、15%、20%、25%、30%)，空白对照组加入等量含正常血清的DMEM培养液，24 h后各孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl,常规培养4 h后吸弃孔内液体，每孔加入DMSO 150 μl,低速振荡10 min混匀，酶标仪在波长为490 nm时测定吸光度(OD值)。细胞存活率(%)=(给药孔OD值-调零孔OD值)/(空白孔OD值-调零孔OD值)×100%。

1.9 倒置相差显微镜下观察各组细胞生长及形态变化 倒置相差显微镜下观察各组细胞生长及形态变化并拍照。

1.10 MTT法检测加味丹参饮含药血清对缺氧/复氧心肌细胞存活率的影响 取对数生长期H9C2心肌细胞制成单细胞悬液后，以5×104个/ml密度接种于96孔板，每孔100 μl，每组设6个复孔，贴壁后按上述方式分组给药，酶标仪测定吸光度值。

1.11 透射电子显微镜观察各组心肌细胞内自噬体形态及数量 各组细胞经上述处理后，收集细胞，加入2.5%戊二醛溶液固定过夜(4℃)，次日用磷酸盐缓冲液洗涤4次，15 min/次，1%锇酸溶液4℃固定2 h后梯度丙酮脱水(50%、70%、90%、100%)，依次经渗透、包埋、聚合、切片、染色等步骤后用透射电镜观察自噬体形态及数量多少。

1.12 实时荧光定量PCR 检测Atg5、Beclin1 mRNA表达 收集培养细胞，按Trizol试剂盒方法提取细胞总RNA，检测RNA纯度及浓度。按逆转录试剂盒方法将RNA逆转录为cDNA，并以cDNA作为模板，用实时荧光定量PCR仪进行扩增。PCR扩增条件：预变性95℃ 2 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环。以β-actin为内参，采用2-△△Ct法对对结果进行分析，△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因，△△Ct=△Ct处理组-△Ct对照组。差别倍数=2-△△Ct，正常对照组的数值设为1。引物序列：β-actin：5'-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3'和5'-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3'；Beclin-1：5'-CTCGTCAAGGCGTCACTTCT-3' 和5'-CCTTAGACCCCTCCATTCCTC-3'；Atg5：5'-TGAGCCTGACCTTGCTTCAG-3'和5'-GTGCCTGTTAATCGGACATGG-3'。

1.13 统计学分析 采用SPSS17.0软件，组间比较采用单因素方差分析，方差不齐采用非参数检验。

2 结 果

2.1 MTT法测定不同浓度加味丹参饮含药血清对细胞存活率的影响 与CG〔(95.10±1.83)%〕比较，各组细胞存活率均降低(P<0.01)，其中，5%含药血清组〔(84.09±5.55)%〕、20%含药血清组〔(82.75±5.55)%〕、25%含药血清组〔(59.61±5.55)%〕及30%含药血清组〔(41.47±8.71)%〕细胞存活率显著降低，而10%含药血清组〔(91.10±8.71)%〕及15%含药血清组〔(89.43±5.54)%〕细胞存活率差异无无统计学意义(P>0.05)，且较5%、20%、25%、30%含药血清组细胞存活率升高(P<0.01)，故选用15%含药血清为最佳工作浓度。

2.2 加味丹参饮含药血清对缺氧/复氧心肌细胞生长及形态变化的影响 倒置显微镜下，CG细胞贴壁生长，呈梭形，折光性大，培养液中见极少量的细胞悬浮；HRG镜下见大量细胞悬浮，细胞形态不规则，折光性降低，细胞间空隙增大，胞质中有空泡及颗粒；JDG及JAG细胞形态较HRG明显改善；JIG细胞形态与HRG相似，见图1。

图1 加味丹参饮含药血清对缺氧/复氧心肌细胞生长及形态变化的影响(×400)

2.3 加味丹参饮含药血清对缺氧/复氧心肌细胞存活率的影响 与CG〔(94.84±0.43)%〕比较，各组细胞存活率均降低(P<0.01)，其中，JDG〔(86.84±1.0)%〕及JAG〔(86.90±1.24)%〕组间细胞存活率比较差异无统计学意义(P>0.05)；与HRG〔(41.94±1.50)%〕比较,JDG及JAG细胞存活率均显著升高(P<0.01)，而JIG(41.95±1.86 %)差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 透射电子显微镜观察各组心肌细胞内自噬体形态及数量 CG胞质内未见明显自噬体形成；缺氧2 h、复氧3 h后(HRG)胞质内出现少量包含胞质内容物的膜状结构(自噬体)；予加味丹参饮预处理后(JDG)自噬体数量增多；加用自噬激动剂后(JAG)自噬体数目进一步增加，予自噬抑制剂后(JIG)自噬体数量减少，见图2。

2.5 加味丹参饮含药血清对缺氧/复氧心肌细胞自噬相关基因Atg5、Beclin1 mRNA表达的影响 与CG比较，各组Atg5 mRNA相对表达量均升高(P<0.01)；与HRG比较，JDG及JAG组间Atg5 mRNA相对表达量进一步升高(P<0.05)，而JIG差异无统计学意义(P<0.05)。与CG比较，除JIG，其余各组Beclin1 mRNA相对表达量均升高(P<0.01)；与HRG比较，JDG及JAG进一步升高(P<0.05)，见图3。

图2 加味丹参饮含药血清对缺氧/复氧心肌细胞自噬体形态及数量的影响(×10 000)

与CG比较：1)P<0.01，与HRG比较：2)P<0.01 图3 加味丹参饮含药血清对缺氧/复氧心肌细胞自噬相关基因Atg5、Beclin1 mRNA表达的影响

3 讨 论

自噬是溶酶体介导的细胞内容物被降解及循环利用的过程，广泛存于真核生物中，对维持细胞的稳态起重要作用〔8，9〕，且参与机体包括感染、肿瘤、神经退行性病变、心肌缺血再灌注损伤等在内的多种病理生理过程。作为真核生物中保守的降解途径，细胞自噬是机体在饥饿条件下的一种存活机制，可在多种类型胁迫期间保护细胞，研究表明急性或慢性心肌缺血中自噬均增加，通过降解胞质内长寿命蛋白等，为关键的生命活动提供所需的营养物质，从而发挥心肌保护作用。然而，自噬也可参与一种与凋亡截然不同的程序性细胞死亡(Ⅱ型程序性死亡)。在心肌再灌注阶段，自噬程度进一步增强，对于自噬在心肌IR损伤中起保护作用还是损伤作用目前尚无统一定论。Decker等〔10〕观察到，在再灌注心肌细胞内自噬泡增多，且自噬泡内含有受损伤的线粒体，提示由自噬上调介导的心肌保护作用可能与其清除受损线粒体有关。然而，有研究发现，在体外培养的心肌细胞采用缺氧再给氧模拟缺血再灌注时，用siRNA阻断Beclin1或用PI3K抑制剂3-甲基腺嘌呤抑制自噬，可减少再灌注时心肌细胞的死亡〔11〕。本研究表明，体外培养H9C2心肌细胞缺氧2 h，再给氧3 h后自噬泡增多，但心肌细胞存活率降低，心肌细胞损伤加重，予加味丹参饮预处理24 h后再予缺氧再给氧处理，自噬泡结构进一步增多，并伴随心肌细胞存活率增加，心肌细胞生长及损伤程度改善，提示在此模型中加味丹参饮通过上调自噬保护缺氧/复氧损伤H9C2心肌细胞。

自噬是受到严密调控的动态过程，包括自噬的诱导、运载物的识别和包装、囊泡成核、囊泡扩展和闭合、Atg蛋白循环、囊泡与液泡/溶酶体融合、囊泡分解，以及所产生的大分子物质的循环利用。其中，Atg5通过形成Atg12-Atg5-Atg16复合物主要定位于吞噬泡的外侧，在自噬体形成期间驱动膜片的扩展和/或弯曲，是参与调控自噬的重要基因。Beclin1与Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-激酶(Vps34)形成Beclin1/Vps34复合物，通过使其他Atg蛋白重定位于前自噬体结构而促进自噬体的形成，3-甲基腺嘌呤可通过干扰Beclin1复合物中hVps34的活性来抑制自噬。Boya等〔12〕研究发现，采用敲除或沉默Atg基因(Atg5、Atgl0、Atgl2及Beclin1)或使用3-甲基腺嘌呤(3-MA)、羟氯喹、渥曼青霉素等药物抑制自噬均可增加营养匮乏环境中细胞的凋亡和死亡。本研究显示，采用实时荧光定量PCR检测各组心肌组织Atg5及Beclin1 mRNA表达，加味丹参饮组较缺氧/复氧组Atg5及Beclin1 mRNA表达均上调，加用自噬激动剂雷帕霉素后表达进一步上调，而自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤可下调Atg5及Beclin1 mRNA表达，此实验结果与电子显微镜下自噬泡数量变化相一致，表明Atg5及Beclin1基因参与了自噬体的形成。

心肌 IR 损伤属于中医“胸痹”、“真心痛”范畴。史载祥教授〔13〕认为冠状动脉血瘀阻络与微循环障碍是心肌IR损伤和再灌注治疗后的重要病理生理机制，活血化瘀成为研究后再灌注时代难题的主要途径。结合中医气血理论：“气能生血，血为气母”、“气为血帅”，益气活血法成为中医防治心肌IR损伤的重要治则。本研究所用加味丹参饮即以益气活血法立法组方，课题组前期研究显示该方可通过抗氧化，抗炎症，抗凋亡等途径抗心肌细胞损伤〔2～4〕，本研究进一步表明该方可通过调节自噬抗H9C2心肌细胞损伤。刘杰民等〔14〕认为细胞自噬是机体正气亏虚下的自救方式，是体内内生瘀血痰浊之邪的自我清除途径；李欣志等〔15〕提出心肌细胞自噬可能是心脏阴阳自和的微观基础。因此，气虚(属阳，细胞自噬功能下降)血瘀(属阴，细胞凋亡和死亡上升)可导致心肌细胞自我保护功能下降，从益气活血角度出发，激发心肌细胞自噬，调节心脏阴阳自和，可能是中医药防治心肌IR损伤的新靶点。

综上所述，益气活血中药复方加味丹参饮预处理对缺氧/复氧损伤H9C2心肌细胞具有延迟保护作用，该机制可能与其上调自噬相关基因Atg5及Beclin1 mRNA表达，上调自噬水平相关。但自噬对细胞的生存具有双重作用，如何通过精细调控自噬减轻心肌缺血再灌注损伤仍需进一步深入探究。

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〔2016-10-19修回〕

(编辑 李相军)

Influence of preconditioning with Jiawei Danshen decoction on expression level of autophagy related gene Atg5 and Beclin1 in H9C2 cardiomyocytes during hypoxia/reoxygenation injury

RAO Chun-Mei,CHENG Xi-Hua,REN Ting,etal.

Hunan University of Chinese Medicine,Changsha 410208,Hunan,China

Objective To investigate the influence of preconditioning with Jiawei Danshen decoction on expression level of autophagy related gene Atg5 and Beclin1 in H9C2 cardiomyocytes during hypoxia/reoxygenation injury.Methods H9C2 cardiomyocytes cultured in vitro were randomly divided into control group(CG),hypoxia/reoxygenation group(HRG),Jiawei Danshen decoction group(JDG),JDG+3-methyladenine(a inhibitor of autophagy) group(JIG) and JDG +Rapamycin(RAPA)(an agonists of autophagy)group (JAG).The inverted microscope was used to observe cell growth and morphological changes.The cell viability of H9C2 cardiomyocytes were measured by MTT assay.Transmission electron microscope was applied to observe the changes of autophagosome formation in cardiomyocytes.The expression levels of Atg5 and Beclin1 mRNA were determined by qRT-PCR.Results Compared with those of CG,the degree of cell necrosis and damage were rised in HRG,the cell viability was declined(P<0.01),the autophagosome formation in cardiomyocytes was increased.Meanwhile,the expression levels of Atg5 and Beclin1gene were up-regulated compared with those of HRG,the cardiomyocyte morphological structure of JDG and JAG were improved,the cell viability of JDG and JAG were increased significantly(P<0.01),the autophagosome formation in cardiomyocytes were increased.In addition,the expression levels of Atg5 and Beclin1gene were up-regulated(P<0.05).Conclusions Preconditioning with Jiawei Danshen decoction has a protective effect on H9C2 cardiomyocytes during hypoxia/reoxygenation injury by up-regulating the expression levels of Atg5 and Beclin1gene.

Jiawei Danshen decoction medicated serum;H9C2 cardiomyocytes;Hypoxia/reoxygenation injury;Autophagy;Atg5 mRNA；Beclin1 mRNA

国家自然科学基金资助项目(81373576，81503536);湖南省中医药管理局重点课题(201304);湖南省教育厅项目(14B136，14C0872);湖南省科技厅一般项目(2014SK3034);湖南省教育厅优秀青年项目(14B136);中西医结合防治心脑疾病的相关基础研究湖南省高校科技创新团队科研项目

成细华(1974-)，女，博士，教授，硕士生导师，主要从事中医药防治糖尿病及其并发症的研究。 黄政德(1955-)，男，博士，教授，博士生导师，主要从事心血管疾病的中医药防治研究。

饶春梅(1989-)，女，在读硕士，主要从事中医药防治糖尿病及其并发症的研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)08-1821-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.001