1,25(OH)2D3减轻小鼠局灶性脑缺血再灌注后炎性反应

石艳超， 陈秀菊， 郭 英

1,25(OH)2D3减轻小鼠局灶性脑缺血再灌注后炎性反应

石艳超1， 陈秀菊2， 郭 英3

目的 探讨1,25(OH)2D3对小鼠局灶性脑缺血再灌注后炎性反应的作用及其机制。方法 造模前，通过一个月低维生素D饮食喂养，小鼠随机分为假手术组、局部缺血再灌注组(模型组)和1,25(OH)2D3组(治疗组)。造模前3 d始，假手术组和模型组每天腹腔注射2.4%乙醇，治疗组腹腔注射1,25(OH)2D3，共持续6 d。再灌注72 h后，Zea Longa法对鼠进行神经功能评分，干湿重法测量缺血侧脑组织含水量，RT-PCR法检测缺血侧半球IL-1β mRNA和TNF-α mRNA表达，采用Western blot法检测缺血侧半球NF-κB p65和Claudin-5的表达。结果 与模型组比较，缺血再灌注后72 h，治疗组小鼠神经功能评分较低，缺血侧半球脑含水量、IL-1β mRNA、TNF-α mRNA和NF-κB p65表达显著减少，Claudin-5表达显著增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 1,25(OH)2D3减轻小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后炎性反应，其机制通过抑制NF-κB的活化有关。

1,25(OH)2D3； 脑缺血再灌注； NF-κB； 炎性反应

炎性反应是脑缺血再灌注 (cerebral ischemia reperfusion injury,CIR) 损伤中复杂的级联反应之一，涉及多种炎性介质、炎性细胞及炎症反应通路，阻断CIR中炎性反应可显著减轻脑损伤。1,25(OH)2D3是维生素D在体内的活性形式，其对哺乳类动物T细胞的表达有影响。有研究表明[1]，在周围和中枢神经系统中，1,25(OH)2D3抑制了炎性反应，对疾病有治疗作用，但其在CIR中的作用尚未明确。本实验通过构造动物模型，观察1,25(OH)2D3对小鼠脑缺血后，神经功能缺损和脑水肿的程度，Claudin-5表达的情况，IL-1β、TNF-α及NF-κB p65等炎性标志物的变化，旨在探讨1,25(OH)2D3对CIR中炎性反应的影响，以期为临床治疗脑梗死提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及处理 健康6周龄雄性C57BL/6J小鼠，体重14～18 g，清洁级。低维生素D饮食喂养一个月后，随机分为假手术组、模型组和治疗组。造模前3 d始，假手术组和模型组腹腔注射同体积的溶于生理盐水的 2.4% (v/v) 乙醇，治疗组腹腔注射1,25(OH)2D3(50 ng/d，Sigma-Aldrich)，共持续6 d。

1.2 小鼠CIR模型制作 参照文献[2]报道的Zea Longa法制备改良线栓法大脑中动脉栓塞模型。术前禁食12 h，不禁饮。腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg麻醉，仰卧位固定于37 ℃恒温电热板上。取颈部正中切口，游离右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，结扎颈总动脉近心端，以无创血管夹夹闭颈总动脉远心端及颈外动脉，于颈总动脉分叉下方剪开一切口，放置预先头端钝化处理的尼龙线(北京沙东生物)，缓慢推进8～10 mm，感觉有阻力时停止，固定于颈总动脉。栓塞1 h后，拔出线栓恢复血流。单笼饲养，自由饮食。再灌注后2 h采用神经功能评分验证造模是否成功，即造模小鼠出现右侧Horner征和左侧以上肢为重的偏瘫，作为动物模型成功的判定标准，剔除不符合标准或死亡的动物，并随机补充。假手术组除不插入线栓外其余相同。

1.3 小鼠神经功能评定 于再灌注后72 h时，进行神经功能评分，参照Zea Longa评分标准：0分,无神经损伤症状；1分,轻微神经功能缺损，不能完全伸展对侧前爪；2分,重度局灶性神经功能缺损，向对侧转圈；3分,重度局灶性神经功能缺损，向对侧倾倒；4分,不能自发行走，意识丧失。

1.4 脑梗死体积的测定 取再灌注后72 h的小鼠，断头取脑置入-20 ℃冰箱内，30 min后取出，自视交叉水平行5个脑冠状切片，片厚约2 mm，将其置于2%的TTC溶液中，37 ℃避光孵育30 min，染色后置于10%甲醛溶液中于4 ℃避光固定24 h，肉眼观察并拍照。应用Image J 1.46 软件计算脑梗死体积，公式为：脑梗死体积(%)=[总的梗死体积-(右侧半球体积-左侧半球体积)]/左侧半球体积×100%。

1.5 脑组织含水量的测定 再灌注后72 h，经神经功能评分后，立即将小鼠断头处死。取缺血侧脑组织迅速称其湿重，然后置于100 ℃高温烤箱内，烘干48 h后称其干重。按照Elliott公式，计算出脑含水量，公式为：脑组织含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.6 Western blot法检测缺血侧脑组织NF-κB p65和Claudin-5的表达 取再灌注后72 h的小鼠，腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg麻醉后，冰PBS心脏灌流，断头取脑。取缺血侧大脑半球，提取脑组织蛋白。采用BCA蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物技术研究所)检测蛋白浓度。每孔加入等量蛋白，10%SDS-PAGE凝胶进行电泳，然后转移至甲醇浸泡过的PVDF膜上，1.5%胎牛血清室温封闭1 h后，分别加入NF-κB p65一抗(1∶1000,CST)、Claudin-5一抗(1∶1000,Introgen)和β-actin一抗(1∶2000,Santa Cruz)，室温孵育12 h后，置入4 ℃冰箱过夜。加入二抗(1∶5000,Transgen Biotech)，室温孵育2 h。每个条带加入显影液发光，采用Image J软件测定灰度值，以目的蛋白条带灰度值与内参β-actin条带灰度值的比值反映目的蛋白的表达水平。

1.7 实时定量PCR 取每只小鼠缺血侧大脑半球，获得总 RNA后取10 μl按照反转录酶Ⅱ试剂盒行逆转录操作，引物序列分别为：IL-1β：上游：5’-GTGGAACTTGAGGCCACATT-3’,下游：5’-TGTGACAAAAATGCCTGGAA-3’；TNF-α：上游：5’-CCAAGCCTTATCGGAAATGA-3’，下游：5’-TCTCACCCAGGGAATTACAAA-3’；内参β-actin 上游 5’-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3’，下游5’-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG- 3’。扩增条件为：95 ℃预变性30 s，进入循环，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，共循环40次，随后95 ℃延伸15 s，60 ℃延伸1 min，95 ℃再延伸15 s，最后降至4 ℃。分别得到IL-1β、TNF-α和内参β-actin的Ct值后，采用相对定量的方法计算，△Ct=目的基因Ct值-内参基因Ct值。以2-△Ct为指标，分别计算出IL-1β、TNF-α和内参β-actin mRNA的相对表达水平。实验重复3次，求得平均值作为分析结果。

2 结 果

2.1 神经功能评分 小鼠取材前进行神经功能评分。假手术组因未闭塞大脑中动脉，未出现神经功能缺损症状，评分均为0分。与假手术组比较，模型组和治疗组的神经功能评分升高(P<0.05)；与模型组比较，治疗组神经功能评分降低(P<0.05)(见表1)。

2.2 脑梗死体积和含水量的测定 假手术组小鼠脑组织未见脑梗死区域，模型组可见明显脑梗死灶(P<0.01)，与模型组相比，治疗组中梗死灶体积明显减小(P<0.05)；3组间脑含水量有明显差异(P<0.05)，治疗组脑含水量较模型组低(P<0.05)(见表2)。

2.3 NF-κB p65和Claudin-5蛋白的表达量 与假手术组比较，模型组和治疗组的NK-κB p65表达明显上调(P<0.05)；与模型组比较，治疗组的NF-κB p65的表达减少(P<0.05)。与假手术组比较，模型组和治疗组的Claudin-5表达明显减少(P<0.05);与模型组比较，治疗组Claudin-5的表达增加(P<0.05)(见图1、表3)。

2.4 IL-1β和TNF-α表达量 与假手术组比较，模型组和治疗组的IL-1β和TNF-αmRNA相对表达量明显升高(P<0.05)；与模型组比较，治疗组的IL-1β和TNF-αmRNA相对表达量明显降低(P<0.05)(见表4)。

表1 脑再灌注后72 h各组小鼠神经功能评分±s)

与假手术组相比较*P<0.05；与模型组相比较#P<0.05

表2 脑再灌注后72 h各组小鼠脑梗死体积及 脑含水量比较±s)

与假手术组相比较*P<0.05；与模型组相比较#P<0.05

表3 脑再灌注后72 h各组小鼠脑组织NF-κB p65和 Claudin-5的表达量

与假手术组相比较*P<0.05；与模型组相比较#P<0.05

表4 脑再灌注后72 h各组小鼠脑组织IL-1β mRNA和 TNF-α mRNA 相对表达量

与假手术组相比较*P<0.05；与模型组相比较#P<0.05

图1 再灌注后72 h，各组小鼠梗死侧脑组织NF-κB p65 和Claudin-5印迹条带

3 讨 论

CIR损伤的机制主要包括兴奋性氨基酸毒性、细胞内钙超载、一氧化碳失调控、炎性反应等。炎性反应在CIR损伤中起着关键作用，加重了脑损害[3～5]，其病理基础以IL-1β和TNF-α等为代表的多种炎性介质失控、释放而形成“瀑布效应”，引起继发性神经细胞变性、坏死、凋亡等[6,7]。IL-1β是触发炎性反应的重要介质之一，脑缺血后其表达增多，对神经元有毒性作用，目前认为其是急性缺血期脑损伤程度的一个标志[8,9]。TNF-α是中枢神经系统参与炎性反应和免疫应答的重要介质，其可激活小胶质细胞、破坏BBB、促进炎性细胞的迁移，最终对神经元造成损伤[4,10～12]。

1,25(OH)2D3是维生素D在体内的活性形式，其除有维持体内钙磷平衡的作用，还有免疫调节作用，在很多疾病中参与免疫反应，下调炎性细胞及致炎性细胞因子的生成，对疾病起到了治疗作用[13]。基于以上研究，我们推测，1,25(OH)2D3通过影响免疫系统对脑梗死可能起到治疗作用。

CIR模型是研究脑梗死较好的动物模型，脑梗死的体积直接反映了脑损伤的严重程度，神经功能评分间接反映了病情的严重程度。本实验连续6 d对实验动物注射1,25(OH)2D3，为了避免食物因素对体内1,25(OH)2D3的影响，参照Joshi S等人研究[14]，在造模前一个月，对实验动物实施了低维生素D饲料喂养。本实验发现，治疗组的神经功能评分及脑含水量低于模型组，提示1,25(OH)2D3能够在一定程度上改善脑梗死小鼠的神经功能减轻脑水肿程度。我们的实验还发现，脑缺血再灌注后，IL-1β和TNF-α炎性因子于梗死侧半球异常过度表达，加重了脑水肿的程度。在多种细胞中，缺血、缺氧诱发了NF-κB的活化[15,16]，活化的NF-κB诱导了细胞凋亡，加重了病情。治疗组中，NF-κB p65的表达明显减少，神经功能评分减低，我们推测1,25(OH)2D3在一定程度上抑制了NF-κB的活化。

Claudin-5与BBB通透性的调节密切相关，其表达变化可作为衡量BBB损伤程度的标志，脑损伤后其表达明显下降，提示BBB透性增加[15,17,18]。为了解1,25(OH)2D3在脑缺血再灌注后对血脑屏障的影响，我们观察了代表BBB功能的Claudin-5的表达水平。实验中发现，与模型组相比较，治疗组中Claudin-5的表达水平降低及脑水肿程度降低，由此，我们推测1,25(OH)2D3具有保护BBB功能，或许能够为脑梗死治疗提供一种方法。

总之，我们的研究发现，1,25(OH)2D3保护了BBB，在一定程度上，抑制了致炎性细胞因子的产生，减少了Claudin-5蛋白的降解，发挥了对BBB的保护作用，减轻了脑水肿和脑梗死体积，促进神经功能的恢复，其机制可能是通过抑制NF-κB的激活，对CIR损伤脑组织起到了一定的保护作用。另外，患者脑梗死后，部分由于进食障碍，造成维生素D摄入减少，可能会加重脑梗死病情。提示我们在临床工作中，重视维生素D在脑梗死患者中的作用。

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1,25(OH)2D3ameliorates inflammatory response after focal cerebral ischemia reperfusion in mice

SHIYanchao,CHENXiuju,GUOYing.

(DepartmentofNeurology,PorthospitalofTianjin,Tianjin300456,China)

Objective To investigate the effect and mechanism of 1,25(OH)2D3on inflammatory response after focal cerebral ischemia reperfusion in mice.Methods After one month of low vitamin D diet,mice were randomly divided into sham-operated group,vehicle group and 1,25(OH)2D3treatment group.3 days before and after the induction of focal cerebral ischemia reperfusion,through intraperitoneal injection,sham-operated group and vehicle group mice were given 2.4% ethanol every day,and 1,25(OH)2D3treatment group mice were given 1,25(OH)2D3.72 h after ischemia reperfusion,neurological function deficits were assessed by Zea Longa method,brain water content was examined by wet and dry weight method,the expression of IL-1β mRNA and TNF-α mRNA in ischemic hemisphere was assessed by RT-PCR method,and Western blot method was used to detect the expression of NF-κB p65 and Claudin-5.Results 72 h after ischemia reperfusion,in 1,25(OH)2D3group,neurological function deficits score,brain water content,the expression of IL-1β mRNA,TNF-α mRNA and NF-κB p65 in ischemic hemisphere were significantly lower or smaller than those in the vehicle group (P<0.05),and the expression of Claudin-5 was significantly higher (P<0.05).Conclusion 1,25(OH)2D3ameliorates inflammatory response of focal cerebral ischemia reperfusion in mice and the mechanism may through inhibits the activation of NF-κB.

1,25(OH)2D3； Cerebral ischemic reperfusion； NK-κB； Inflammatory response

1003-2754(2017)04-0304-04

2016-12-20；

2017-03-30

(1.天津港口医院神经内科，天津 300456；2.天津南开医院神经内科，天津 300381；3.天津医科大学总医院耳鼻喉科，天津 300052)

陈秀菊，E-mail:91sqs@sina.com

R743.3

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