主成分分析下磐安浙贝母鳞茎最佳采收期的研究

楼柯浪 陶倩 张水利 俞冰 睢宁 张春椿

浙江中医药大学 杭州 310053

主成分分析下磐安浙贝母鳞茎最佳采收期的研究

楼柯浪 陶倩 张水利 俞冰 睢宁 张春椿

浙江中医药大学 杭州 310053

[目的]测定磐安浙贝母鳞茎主成分的含量，确定浙产浙贝母最佳采收期。[方法]分别采用HPLC-ELSD、酸性染料比色法、生物量法测定磐安地区浙贝母不同生长期鳞茎中贝母素甲、贝母素乙、总生物碱和生物量。[结果]磐安地区浙贝母鳞茎总生物碱含量在3月底、4月初最低，在5月初达到峰值，而鳞茎贝母素甲和贝母素乙含量变化规律则与其相反。结合生物量后，浙贝母鳞茎主成分含量在4月底5月初达到最高值。[结论]结合浙贝母鳞茎生物量、地上部分的生物学特性进行综合判断，磐安地区浙贝母最佳采收期在其果期末期、枯萎初期。

浙贝母；总生物碱；含量测定；生物量；采收期；磐安；浙八味

浙贝母为百合科(Liliaceae)植物浙贝母（Fritillaria thunbergii Miq．）的干燥鳞茎，味苦，性寒，归肺心经，具有清热化痰、开郁散结之功效，常用于风热、燥热、痰火咳嗽、乳痈、肺痈、瘰疬、心胸郁闷、疮毒等症[1]。现代药理研究发现，浙贝母具有镇咳、祛痰、抗炎等作用[2]。对浙贝母的化学成分研究表明，浙贝母生物碱是其止咳、化痰和平喘等作用的有效成分[3]。浙贝母于每年10月下旬发根，次年2月发芽，花果期在3月底到4月中上旬，5月枯萎，通常于植株枯萎时采收。

浙江磐安为浙贝母的主产区，种植约 7.5× 104hm2，年产量600多吨[4]。但浙贝母采收时间往往根据个人经验和市场供求来判断的，造成采收期范围波动较大，直接影响了药材质量。为合理评价浙贝母药材质量，揭示浙贝母主产区磐安的浙贝母鳞茎生物碱类有效成分含量与生物量之间积累动态规律，本文采用HPLC-ELSD、酸性染料比色法、生物量法，分别测定浙贝母鳞茎中贝母素甲、贝母素乙、总生物碱和生物量含量，综合生物学特性，确定其最佳采收期。

1 实验材料

1.1 仪器 AR224CN电子天平[奥豪斯仪器（上海）有限公司]；GZX-9070 MBE电热鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司）；Spectrumlab 22PC紫外分光光度计（上海棱光技术有限公司）；PHS-3TC型pH计（上海天达仪器有限公司）；B-220型电热恒温水浴锅（上海亚荣生化仪器厂）；KQ-2200DA型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Waters1525高效液相色谱仪（美国waters公司）；Empower 2色谱工作站（美国waters公司）；Waters2424蒸发光散色检测器（美国waters公司）；HypersilC18（250mm×4.6mm，5μm，大连依利特分析仪器有限公司）；KQ2200DA型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂 贝母素甲对照品（批号：110750-201110，中国生物制品检定所）；贝母素乙对照品（批号：110751-200709，中国生物制品检定所）；乙腈（色谱纯，批号：3BA0015，Spectrum Chemical Mfg.Corp.）；溴麝香草酚蓝、邻苯二甲酸氢钾、碘化铋钾、氢氧化钠、甲醇、二氯甲烷、三氯甲烷、冰乙酸、乙酸乙酯均为分析纯。

1.3 供试药材 浙贝母鳞茎于不同时期采于浙江磐安大盘山，见表1。经浙江中医药大学张水利教授鉴定为百合科植物浙贝母（Fritillaria thunbergii Miq.）的鳞茎。

表1 供试药材采集时间与生物量Tab.1 Collection time and biomass of tested materials

2 方法与结果

2.1 浙贝母鳞茎生物量的测定 将不同时期采来的新鲜浙贝母鳞茎洗尽，去芯芽，切厚片，晒干至恒重，称重，计算其平均质量作为生物量，结果见表1。以时间为横坐标，浙贝母的生物量为纵坐标作图可以看出浙贝母鳞茎的重量在4月上、下旬和5月后增长缓慢，而在4月中旬增长迅速。见图1。

2.2 浙贝母鳞茎总生物碱含量的测定

2.2.1 样品溶液的制备 分别取不同时期采收的浙贝母鳞茎粉末（过四号筛）约2.00g，精密称定，置锥形瓶中，加浓氨水4mL浸润0.5h，精密加入三氯甲烷：甲醇（4:1）的混合溶剂40mL，称定，混匀，置超声仪（80W）中超声1.0h，放冷，再称定，加上述混合溶剂补足质量，滤过，精密量取续滤液10mL，置蒸发皿中蒸干，残渣加三氯甲烷溶解并转移至10mL容量瓶中，加三氯甲烷稀释至刻度，摇匀。

图1 浙贝母时间-生物量曲线图Fig.1 Biomass time curve of Fritillaria thunbergii Miq．

2.2.2 最大吸收波长的确定 精密称取贝母素乙对照品2.4 mg，加三氯甲烷溶解并定容于10mL容量瓶中。精密吸取此标准品液2.0mL，加三氯甲烷使成15mL，置于分液漏斗中，再加入pH=5.0的邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠缓冲液2mL，再加入0.001mol·L-1麝香草酚蓝指示液2mL[5]，振摇15min，静置30min后，分取三氯甲烷层，在350～650nm的波长处扫描；另取2.2.1项下不同时期采收的浙贝母鳞茎样品液和三氯甲烷15mL，以同样方法操作。如图2可知浙贝母生物碱在酸性染料中最大吸收波长为415nm，根据“吸收最大，干扰最小”的原则确定浙贝母总生物碱测定的吸收波长为415nm。

图2 生物碱酸性染料液的紫外——可见光吸收光谱Fig.2 UV Vis absorption spectra of acid dye solution

2.2.3 标准曲线的建立 分别精密吸取“2.2.2”项下贝母素乙对照品溶液0.1、0.6、1.1、1.6、2.1mL至15mL容量瓶中，加三氯甲烷使成15mL，置于分液漏斗中，按照“2.2.2”项下方法进行比色测定，以贝母素乙的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，作标准曲线，得回归方程Y=0.0302X+0.1026，R2=0.9995。贝母素乙在1.6～33.6μg·mL-1的范围内具有良好的线性关系。

2.2.4 精密度实验 精密吸取对照品溶液0.5mL至15mL容量瓶中，6份，按照“2.2.2”项下方法操作，测定吸光度。结果RSD=0.37%(n=6)＜3%，表明仪器性能良好。

2.2.5 重复性实验 取3号浙贝母鳞茎6份，按“2.2.1”项下方法提取总生物碱；精密移鳞茎供试品溶液0.2mL，按“2.2.2”项下操作，于最大吸收波长处测定吸光度，计算RSD=0.55%(n=6)＜3%，表明实验重复性良好。

2.2.6 显色稳定性实验 精密量取对照品贝母素乙溶液0.5mL至15mL容量瓶中，按照“2.2.2”项下方法操作，样品显色后0、10、30、45、60、90、120min后于最大吸收波长处测定吸光度值。计算RSD=0.37%(n=6)＜3%，表明显色在2h时间段内是稳定的。

2.2.7 加样回收实验 精密称取已知含量的9份3号浙贝母鳞茎粉末2.00g，加入浓氨试液4 mL，再分别加入相当于贝母素乙对照品0.096、0.12、0.144mg浓度的溶液，每个质量平行3份，浸润30min，置具塞锥形瓶中，精密加入用三氯甲烷∶甲醇（4:1）的混合溶液40mL，按优化后的提取方式提取，制得样品溶液，取0.1mL样品溶液至15mL容量瓶中，按照“2.2.2”项下方法操作，以相应试剂为空白，采用紫外-可见分光光度法，在最大吸收波长处测定吸光度，根据标准曲线计算回收率，RSD=2.93%(n=9)＜3%，表明回收率良好。

2.2.8 总生物碱含量测定 精密吸取“2.2.1”项中所得样品溶液0.1mL，置15mL容量瓶中，按“2.2.2”项下方法操作，以相应试剂为空白，采用紫外-可见分光光度法，在最大吸收波长处测定吸光度。总生物碱量时间变化趋势见图3。

2.3 浙贝母鳞茎指标性成分检测

2.3.1 色谱条件 色谱柱：Hypersil C18（250mm×4.6 mm，5μm）；柱温：25℃；流动相：乙腈-（含0.05%三乙胺）水（75:25）。

2.3.2 样品溶液的制备 在《中国药典》（Ⅰ部）（2010版）[1]中记载样品溶液制备方法上稍加改变，提取时由回流改为超声。分别取不同产地浙贝母鳞茎粉末（过60目筛）2.00g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨水试液4.00mL，浸润30min，精密加入氯仿∶甲醇（4:1）的混合溶剂40mL，称定，混匀，超声提取1h。再称定，加上述氯仿∶甲醇（4:1）的混合溶剂，补足重量，滤过。精密量取上述滤液10mL，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并定量转移至10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得，作为样品溶液备用。

图3 浙贝母总生物碱量变化曲线图Fig.3 The total alkaloid change curve of Fritillaria thunbergii Miq.

2.3.3 对照品溶液的配制 取贝母素甲对照品、贝母素乙对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成1.0mL含贝母素甲0.20mg、贝母素乙0.22mg的溶液，即得，作为对照品溶液备用。

2.3.4 指标性成分含量测定 分别精密吸取对照品溶液10μL、20μL，“2.3.2”项下样品溶液5~15μL，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程分别计算贝母素甲、贝母素乙的含量。浙贝母色谱图见图4，贝母素甲（进样量为20μL）和贝母素乙（进样量为15μL）对照品HPLC-ELSD色谱图见图5、6。以生物量与贝母素甲、贝母素乙含量乘积值进行综合分析，描述其积累规律，见表2。贝母素甲、贝母素乙含量的时间变化曲线图见图7。浙贝母生物碱累积变化趋势图见图8。

表2 6批次贝母素甲、素乙累积量Tab.2 Six batches of medicinal materials peimine,peiminine accumulation

3 分析与讨论

3.1 生物量 广义的生物量是生物在某一特定时刻单位空间的个体数、重量或含能量，可用于指某种群、某类群生物的（如浮游动物）或整个生物群落的生物量。狭义的生物量仅以重量表示，可以是鲜重，或者是干重。本文所测生物量均为狭义的生物量，即为浙贝母鳞茎的干重。

图4 3月30号浙贝母样品HPLC-ELSD色谱图Fig.4 In March 30th,HPLC-ELSD chromatography of Fritillaria thunbergii Miq.

图5 贝母素甲标准品HPLC-ELSD色谱图Fig.5 HPLC-ELSD chromatography of Peimine standard

图6 贝母素乙标准品HPLC-ELSD色谱图Fig.6 HPLC-ELSD chromatography of Peiminine standard

3.2 总生物碱 浙贝母所含生物碱种类繁多，如需准确地测定总生物碱含量，则应分离得到所有个体生物碱后再行测定，此操作繁琐耗时，资源消耗大。总生物碱的测定一般以其中主要生物碱为代表计算的近似值，而已知浙贝母中贝母素乙含量丰富，检测方法相对贝母素甲较为成熟，因此本文采用常用总生物碱检测法酸性染料比色法，以贝母素乙含量作为总生物碱的近似值进行测定。

图7 贝母素甲、贝母素乙含量的时间变化曲线图Fig.7 Peimine,peiminine content of the time change curve

图8 浙贝母生物碱累积变化趋势图Fig.8 Change trend of alkaloids accumulation of Fritillaria thunbergii Miq.

3.3 浙贝母鳞茎不同成分的最佳采收期 由图1可以看出浙贝母鳞茎的生物量在4月中旬增长迅速，于4月底之后增长速度放缓，趋于平稳状态，甚至有下降趋势，可能是因为浙贝母种质之间的差异造成的，也可能是因为花果期植株整体消耗增大，营养成分供不应求，浙贝母鳞茎生物量分解用于支撑植物生长发育。若单纯以生物量为指标，则浙贝母最佳采收期在4月底之后。

由图3可知，浙贝母总生物碱从3月底到4月底5月初总体呈增长趋势，5月10日和5月21日相差不大，较5月1日呈下降趋势，趋于平缓。若单以浙贝母总生物碱为指标，则浙贝母最佳采收期在4月底、5月初期。并且浙贝母总生物碱结合生物量之后可更直观的发现采收浙贝母实现价值最大化的时间亦在4月底5月初期，即浙贝母花果期。王艳红等采用酸性染料比色法与两相滴定法测得的实验结果说明不同采收期的平贝母中总生物碱高含量有两个时期，即花果期与 8月开始延至 10月份的枯萎中后期[6]。而在李松林等采用酸性染料比色法测定江苏南通和浙江宁波两产地不同月份的浙贝母总生物碱的月积累动态，确定了浙贝母以5月份为最佳采收期[7]。由此可初步推断贝母总生物碱含量在其花果期达到峰值。

由图7可以看出，贝母素甲和贝母素乙含量随着时间变化整体呈下降趋势，3月30日到4月9日下降最快，之后趋于平缓。若以贝母素甲和贝母素乙含量为判断指标，则最佳采集时间为3月底4月中上旬，与王和平等得出的结论一致[8]。但综合其生物量不难发现，浙贝母贝母素甲和贝母素乙的量从4月上旬快速升高，5月初之后放缓，如图8。若只单考虑总生物碱或其主要有效成分，没有从鳞茎的生物量变化与其内在的有效成分含量之间的关系来说明，会导致确定采收期的时间比较模糊，甚至两者结论完全相反。

3.4 环境因子对浙贝母鳞茎采收期的影响 本实验以浙贝母鳞茎生物量结合总生物碱、贝母素甲和贝母素乙含量为判断指标可确定磐安地区浙贝母最佳采收期为4月底5月初，即浙贝母花果期末期，枯萎初期。但因地理环境不同，气候差异，土壤差别等环境因子影响，无法以偏概全确定全国浙贝母最佳采收期。如郑坚等发现浙江文成、江苏南通浙贝母出苗早于浙江鄞县、文成、鄞县浙贝母，枯萎期早于南通[9]。浙贝母的强适应性使其无论高低海拔，内陆海岛均能适应生长。因此固定的时间节点无法准确地描述全国范围内浙贝母的最佳采收期，还需结合浙贝母地上部分生物学特性进行综合判断。

3.5 浙贝母鳞茎的最佳采收期 本实验发现浙贝母鳞茎总生物碱、贝母素甲和贝母素乙质量增长趋于平缓时正处于浙贝母花果期与枯萎期过渡阶段，与王艳红、李松林等人[6-7]测得浙贝母总生物碱含量在花果期处于峰值、果期与枯萎期出现低程度下降相符。由此可初步判断，浙贝母最佳采收期在其果期末期、枯萎初期。

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Study on the Best Harvest Time of Fritillaria Thunbergii in Pan'an Based on Main Components

LOU Kelang,TAO Qian,ZHANG Shuili,et al Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China

[Objective]Dynamic changes of biomass and alkaloids of Fritilarise thunbergii Bulbus were determined to assess the optimal collection time. [Methods]The contents of total alkaloids in the bulbs of Fritillaria thunbergii at different growth stages were determined by HPLC-ELSD,acid dye colorimetric method and biomass method.[Results]The total alkaloid content of Fritillaria thunbergii bulb in Pan’an in late March and early April the lowest peak in early May,and the bulb of peimine and peiminine in the opposite.Combined with biomass,the main components in bulbs of Fritillaria thunbergii reached the highest value at the end of April and early May.[Conclusion]Combined with the biomass in bulbs of Fritillaria thunbergii and the biological characteristics of the ground part of the comprehensive judgment,we found that the best harvest period of Fritilarise thunbergii.was between the end stage of its fruit stage and the early stage of withering stage.

Fritillaria thunbergii Miq.;total alkaloids;determination of content;biology quantity;harvest period；Pan’an；eight drugs in Zhejiang

R282.71

A

1005-5509（2017）04-0329-07

10.16466/j.issn1005-5509.2017.04.018

2016-12-21）

浙江省中药现代化专项资金项目（浙经信医化〔2010〕492号）；国家自然科学基金青年基金（81603222）；浙江省博士后科研项目择优资助（浙人社发[2016]73号）；浙江省自然科学基金项目（LY12H28006）

Fund projects:Zhejiang Province specialfund project"The modernization oftraditionalChinese medicine(Z.J.X.Y.H [2010]492);National Natural Science Foundation of Zhejiang Province(81603222);Merit funded postdoctoral scientific research project(Z.R.S.F[2016]73)；Zhejiang Provincial Natural Science Foundation Project(LY12H28006).

张春椿，E-mail：10928485@qq.com