海芋多糖提取工艺优化及其单糖组成分析

陈小芳 钟晓明 黄真 应夏丽 梁利

浙江中医药大学 杭州 311402

海芋多糖提取工艺优化及其单糖组成分析

陈小芳 钟晓明 黄真 应夏丽 梁利

浙江中医药大学 杭州 311402

[目的]优选海芋Alocasia macrorrhiza(Lour.)Schott多糖的最佳提取工艺，并分析其单糖组成。[方法]通过L9(34)正交试验设计，以多糖提取率为评价指标，优选海芋多糖的最佳提取工艺；多糖经酸水解、PMP衍生化，高效液相色谱分析其单糖组成。[结果]海芋多糖的最佳提取工艺：95℃，料液比1:20，回流提取3次，每次2h；在此条件下，多糖提取率为11.20%；PMP衍生化高效液相色谱法分析得海芋多糖主要由甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等单糖组成。[结论]本实验成功建立简便、稳定可行的海芋多糖提取工艺，并对其单糖组成进行了研究，为合理地开发海芋资源提供了一定理论依据。

海芋多糖；提取工艺；正交试验；优化；葡萄糖；单糖；柱前衍生化

海芋为天南星科Araceae海芋属Alocasia植物海芋Alocasia macrorrhiza(Lour.)Schott的干燥根茎，又名天荷、滴水芋、广东狼毒、野芋头等[1]。海芋味辛，性寒，有毒，具有清热解毒、行气止痛、散结消肿之功，常被用于高热流感、风湿关节炎、疔疮肿毒、蛇虫叮咬等方面的治疗[2]。海芋主要成分有凝集素、多糖、脑苷、氰苷等[2-4]。现代研究表明，海芋具有一定的抗肿瘤[5-6]、解热[7-8]、抗炎镇痛[9]、抗真菌[10-11]、抗氧化[12]等生物活性。

近年来，多糖的药理活性研究已成为热点，大量研究表明多糖具有促进免疫调节、抗肿瘤、抗氧化等多种生物活性[13-14]。而海芋多糖作为海芋的主要有效成分之一，其相关研究较少[2]。本文旨在对海芋多糖提取工艺优化及单糖组成进行系统探讨，为海芋多糖的深入研究提供实验基础及理论依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 BS124S型电子分析天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司），RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），5430R高速冷冻离心机（德国艾本德公司），UV-1800紫外分光光度计（岛津中国），Waters 1525型泵、2489型紫外检测器、breeze 2色谱工作站（美国waters公司）。

1.2 试药 海芋自采于重庆地区，经浙江中医药大学药学院中药资源鉴定研究所陈孔荣副教授鉴定为天南星科Araceae海芋属Alocasia植物海芋Alocasia macrorrhiza(Lour.)Schott的干燥根茎。阿拉伯糖（批号：1506-200001）、D-半乳糖醛酸（批号：111646-200301）、D-无水葡萄糖（批号：110833-200904）、D-甘露糖（批号：140651-200301）、D-半乳糖（批号：100226-201105）购自中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯（美国TEDIA），其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 海芋多糖的提取 称取海芋粉末3g，95%乙醇回流提取6h，进行脱脂预处理，抽滤，药渣挥尽醇，加入60mL蒸馏水，95℃回流提取2h，过滤，滤液蒸馏水定容至100mL容量瓶中，取1mL加入5倍预冷95%乙醇，4℃静置过夜，离心（4000r/min）10min，弃上清得海芋粗多糖，加入热蒸馏水溶解，稀释，即得海芋多糖供试品溶液[15-17]。

References:

1.做好成果转化的流程衔接。研究发现，就整个科研成果转化过程而言，需要重点关注选题、衔接、推广、交流、配套五个关键环节，实做好应用型研究导向、科研项目与生产实践的对接、科研成果的推广传播、博士后及相关技术人员的培训、转化应用配套条件。

2.2 海芋多糖的测定

结合新闻报道、学术研究以及裁判文书网，笔者发现针对共享单车不法行为类型繁多，处罚方式各异。总结对共享单车的不法行为，笔者发现三种较为典型的不法行为：私藏共享单车、给共享单车上私锁以及毁坏共享单车。相较于传统犯罪，针对共享单车的犯罪属于“新生事物”，因而理论界和司法界对于针对共享单车的刑法规制众说纷纭，各执一词。以下，笔者将对这三种典型不法行为的刑事责任进行探讨。

2.2.1 葡萄糖对照品溶液的配制 精密称取干燥至恒重的葡萄糖对照品20.00mg，溶解，转移至10mL容量瓶，蒸馏水定容至刻度，即得2.00mg·mL-1的葡萄糖对照品溶液，备用。

2.2.2 检测波长 精密吸取葡萄糖对照品溶液0.1mL，定容至25mL容量瓶中，后吸取2mL对照品溶液，置于具塞试管，加入1mL 5%苯酚溶液，涡旋混匀，再快速加入5mL浓硫酸，涡旋20s，沸水浴20min，取出，冰水浴冷却10min，另取上述海芋多糖溶液2mL，同法操作，蒸馏水作为空白试验，在300～800nm波长范围内扫描[17-18]。结果海芋多糖溶液在489nm 波长处有最大吸收与葡萄糖对照品溶液在490nm波长处的最大吸收非常接近。因此，最终确定检测波长为490nm，如图1-1、1-2。

图1-1 葡萄糖紫外扫描谱图Fig.1-1 Ultraviolet absorption spectrum of glucose

图1-2 海芋多糖紫外扫描谱图Fig.1-2 Ultraviolet absorption spectra of Polysacharide

2.5.6 海芋多糖的单糖组成测定 精密称取海芋多糖3份，每份20mg，按2.5.3项下制备样品，2.5.4项下进行衍生化处理，在上述色谱条件下进行测定，用标准曲线法计算各单糖含量。测定结果表明海芋多糖主要由甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖构成，其含量分别为 4.04%、4.08%、82.50%、7.97%、1.40%，见图2。

2.2.4 海芋多糖提取率的测定 取海芋多糖供试品溶液2mL，按2.2.2项下操作测定吸光度。根据回归方程计算海芋多糖供试品溶液中多糖的质量浓度。再按下列公式计算海芋多糖提取率。

海芋多糖提取率=多糖质量浓度（mg·mL-1）×液体体积（mL）×稀释倍数/海芋粉末质量（mg）×100%。

2.3 海芋多糖提取条件的优化 通过预实验结果，以海芋多糖提取率为考察指标，对提取温度（A）、料液比（B）、提取时间（C）、提取次数（D）4个因素进行考察，因素水平见表1。称取海芋粉末3g，平行9份，置于圆底烧瓶中，按L9(34)正交试验表分别进行回流提取，按2.1项下处理提取液，2.2项下测定及计算。试验设计及结果见表2。不考虑交互作用，进行方差分析，结果见表3。

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表1 海芋多糖提取工艺的因素水平表Tab.1 Factors and levels of polysaccharide extraction process

表2 L9(34)正交试验设计与结果表Tab.2 Results of L9(34)orthogonal array design and range analysis

表3 方差分析Tab.3 Analysis of varlance

2.5 海芋多糖的组成分析

2.5.1 色谱条件 色谱柱：Sunfire TM C18（4.6×250mm，5μm）；流动相：乙腈-0.02mol·L-1乙酸铵溶液（20: 80），0.45μm滤膜过滤，超声脱气；流速：0.8mL·min-1；柱温：30℃；检测器：紫外检测器，检测波长为250nm；进样体积：10μL。

2.5.2 混合对照品溶液的配制 分别精密称取对照品甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖3.01、6.01、40.01、5.06、2.57mg，溶解，转移至20mL容量瓶，蒸馏水定容至刻度，混匀，即得混合对照品溶液。

在2016年1月—2018年1月之间展开本次研究，选择对应研究时间段内的50例多发性骨髓瘤患者作为研究对象，50例患者的年龄为40～79岁，平均年龄为（62.38±2.34）岁，患者的病程为10天～8个月，平均病程为（6.94±1.39）个月；患者中27例男性、23例女性，其均伴随有不同程度的全身疼痛现象，且15例患者主诉腰背疼痛感明显、8例患者有肩痛不适感；除过以疼痛感觉为主要表现外，多数患者存在头晕、心悸等不适症状。本次研究前患者或家属均已经了解研究概况，入选者均在知情的基础上同意参加本次研究[2]。

2.5.3 样品溶液的制备 精密称取由最佳工艺提取的海芋多糖20mg，置顶空瓶中，1.0mL蒸馏水溶解，加3.0mol·L-1盐酸溶液3mL，封口，混匀，110℃水解1h，放冷，3.0mol·L-1NaOH溶液调节pH值至中性，蒸馏水定容至10mL容量瓶，离心（5000r·min-1）10min，取上清，备用[19-20]。

2.5.5.4 重复性试验 精密称取海芋多糖6份，每份20mg，按2.5.3项下制备样品，2.5.4项下进行衍生化处理，在上述色谱条件下进行测定，测定结果表明甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的峰面积RSD分别为1.64%、3.92%、1.59%、1.14%、3.25%，表明本方法重复性较好。

2.5.5 方法学考察

2.5.5.1 混合对照品标准曲线的绘制 精密吸取混合对照品溶液0.25、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分别置于10mL量瓶中，蒸馏水定容至刻度线，摇匀，作为系列对照品溶液。按2.5.4项下进行衍生化处理，按上述色谱条件进行分析，记录色谱图。以对照品溶液浓度（μg·mL-1）为横坐标X，相应标准品峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线并计算回归方程。甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的回归方程及其线性关系，见表4。

表4 5种单糖的回归方程和线性范围Tab.4 Linear equations with correlation coefficients and linear ranges of five monosaccharose

2.5.5.2 精密度试验 取混合对照品溶液，按2.5.4项下进行衍生化处理，在上述色谱条件下，重复进样6次，测定结果表明甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的峰面积RSD分别为0.71%、2.37%、0.42%、0.37%、0.41%，表明仪器精密度良好。

2.5.5.3 稳定性试验 精密称取海芋多糖20mg，按2.5.3项下制备样品，2.5.4项下进行衍生化处理，在上述色谱条件下，于0、2、4、6、8、12、24h分别进样，测定结果表明12h内甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的峰面积RSD分别为0.72%、5.3%、0.52%、0.42%、0.41%，12h后半乳糖醛酸极不稳定，表明衍生化后的海芋多糖水解液在12h内稳定性较好。

2.5.4 PMP衍生化方法 精密吸取混合对照品溶液或海芋多糖溶液400μL，加0.5mol·L-1PMP甲醇溶液与0.3mol·L-1氢氧化钠溶液各400μL，混匀，70℃水浴反应100min。冷却至室温，加500μL 0.3mol·L-1的盐酸溶液，混匀，氯仿洗涤3次，每次2mL，离心取上清，0.45μm微孔滤膜过滤，即得[19-21]。

⑵工作原理，用户通过Web节目提前了解所需停车附近区域的各个停车场信息，包括停车数量、到达路线等信息来选择合适的停车点。当车低速抵达停车场入口时自动远程读写设备就会探测到车辆的电子标签，然后车辆的相关信息就会被读入系统，并将这些信息传送给物联网数据平台，经过数据处理决定是否给予停车权限并同时记录相关信息。当车辆正常入库则平台系统会记录相关信息，更新停车数量、车位等信息，并通过Web来更新信息。如果车辆无法被识别那么系统会反馈信息，由停车管理系统引导用户停车，并自动存储记录该车辆信息，同时更新Web信息[3]。

2.5.5.5 回收率试验 精密称取已知含量的样品6份，每份10mg，分别精密加入已知含量的混合对照品溶液，按2.5.3项下制备样品，2.5.4项下进行衍生化处理，在上述色谱条件下进行测定，测定结果表明甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的平均回收率分别为99.6%、102.1%、96.4%、98.8%、98.0%；其RSD分别为1.72%、3.12%、1.15%、0.90%、1.37%。

2.2.3 葡萄糖标准曲线的绘制 精密吸取葡萄糖对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL分别置25mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀。分别吸取上述溶液2mL，按2.2.2项下操作测定吸光度。以吸光度为纵坐标Y，葡萄糖浓度为横坐标X，绘制回归曲线，计算得回归方程Y=0.0581X+0.0285，r=0.9992。结果表明葡萄糖浓度在2.95～11.56ug·mL-1之间与吸光度呈良好的线性关系。

3 讨论

苯酚-硫酸法是目前测量多糖含量常用方法之一，其中单糖对照品的合理选用是多糖含量测定过程中普遍存在的问题。有学者使用苯酚-硫酸法对同一植物多糖含量进行测定，研究发现以半乳糖为对照所测多糖含量值较葡萄糖大30%以上[22]。由于不同单糖所绘制的标准曲线斜率不同，只有选择合适的对照品才能得到最佳测定结果。有文献[23]报道对于未知的杂多糖应以主要组成单糖为其对照品进行测定。本实验参考文献[15,24]及预实验结果，选择以葡萄糖为对照品，而最大吸收波长及PMP柱前衍生化分析结果均体现了该对照品选择的合理性。

设计意图：教师引导学生明确遗传物质应该具有的特点，使学生能够理解为什么当时科学家会认为蛋白质是遗传物质。

程磊等[15]对海芋多糖组成进行了研究，初步确定海芋多糖由葡萄糖、半乳糖和甘露糖3种单糖组成。王辉等[24]也对海芋多糖的组成进行了分析，认为其主要由葡萄糖、鼠李糖组成。本实验通过PMP柱前衍生化高效液相色谱法对海芋多糖组成进行了分析，结果表明其主要由甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖构成，对文献报道进行了补充，数据存在一定出入，这可能是因为检测方法的灵敏度或海芋产地的不同所造成。本实验还发现，多糖经水解衍生化，各单糖衍生物稳定性存在差异，其中半乳糖醛酸衍生物信号衰减较为迅速，故该部分实验均在自衍生化后12h内完成。

图2 海芋多糖色谱Fig.2 HPLC chromatograms

海芋分布广泛，易于栽培，具有一定的药用价值，属于民间习用药。目前海芋相关研究主要集中在抗癌、抑菌等方面，而对海芋多糖的相关研究较少。本实验对海芋多糖的提取工艺及组成进行系统研究，旨在为海芋多糖的进一步研究奠定基础。

选定地块后，应考虑土壤生态环境对黄芩生长的影响，张向东等研究发现，随着土壤紧实度增大，黄芩根系活力降低，加速植株衰老[25]；土壤中有重金属元素累积时，黄芩中重金属含量与土壤中重金属含量成正比[26]。黄芩连作障碍来自于生长年限延长，土壤中真菌含量随之增加，且根际真菌增长幅度显著高于非根基区域[27]，提高根腐病发病几率[6]。

由于我国东部地面雨量观测站点多且分布密度大,而西部观测站点少、分布密度小且地形复杂(潘旸等,2012;沈艳等,2010,2013;Shen and Xiong,2015)。为了更加客观地分析IMERG产品在我国大陆地区的降水估计精度,本文以100°E为界(廖荣伟等,2015),将中国大陆分为东、西两部分(记为“东部”和“西部”)进行研究。

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根据直观分析及方差分析结果可知，各因素对海芋多糖提取工艺的影响程度为D＞A＞C＞B，且表明A、D因素具有显著影响。直观分析表明，海芋多糖的最佳提取工艺为A3B1C2D3，即提取温度为95℃，料水比为1:20（g·mL-1），提取时间为2h，提取次数为3次。

2.4 验证试验 称取海芋粉末3g，平行3份，按最佳工艺提取，海芋多糖平均提取率分别为11.26%、11.10%、11.25%，平均提取率为11.20%，RSD值为0.80%，表明该工艺稳定可行。

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1) 从泵进口到出口，压力逐渐增大；随着泵进口压力降低，流道内低压区范围增大，高压区范围减少以至消失。

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黑背心拿上包，泰森套上汗衫，我不知道他们忙碌起来要干什么，仍吃着锅巴。泰森恶狠狠地说：“不吃了，出发！”

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白煞留下和铁卫连夜清理黑旗会分坛，因为与黑旗会博弈须要充裕的银子作基础，所以萧飞羽临走时吩咐将所有值钱的东西带去安和庄，余下的事情交给樊虎带领的伙计。白煞和铁卫搜索发现天问大师和紫阳道长要找的少林俗家弟子之首的白云飞竟然囚禁在地牢里。

使用水力清淤混合器可以清除河道淤泥，效果比较好。要确定清淤器的水喷嘴和喉管的比例，喷嘴和吸泥管的比例范围，需在一定的标准范围内才行。像喉管横截面的长度和直径要相同，才能保证混合泥浆处于稳的状态；扩散管需做成锥形，减少能量转化时的能量损失，提高泥浆的位能；泥浆吸入时需要于泥浆相等量的高压水，保证充分的混合稀释，保证泥浆的流速；保证喷嘴处的高压水流速适宜，水压比例在喷嘴水压的有效值内。一般来说，清淤机的工作效率并不高，不到水泵效率的的一半。10%-40%。

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周末，我正在闷头吃早饭，旅行社给我打来电话。没错，我给自己报了个旅行团，我还有点积蓄，等这趟旅行回来，一切从头开始也来得及。

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Optimization of Extraction Process of Polysaccharide from Rhizome of Alocasia Macrorrhiza and Monosaccharide Composition Analysis

CHEN Xiaofang,ZHONG Xiaoming,HUANG Zhen,et al Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(311402),China

[Objective]To optimize the extraction process for polysaccharide from rhizome of Alocasia macrorrhiza and analyse the monosaccharide composition.[Methods]The rate of polysaccharide from rhizome of Alocasia macrorrhiza was used as the index by L9(34)orthogonal design to optimize the best technique.Pre-column Derivatization HPLC was used to analyse the monosaccharide composition of polysaccharide from rhizome of Alocasia macrorrhiza, which was hydrolyzed by 3.0mol/L HCl.[Results]The optimal technological condition of extraction process for polysaccharide from rhizome of Alocasia macrorrhiza was as followed:the extraction temprature was 95℃,material-liquid ratio was 1:20,the extraction time was 2h for 3 times.With the optimal extraction condition,the yield of polysaccharide from rhizome of Alocasia macrorrhiza was 11.20%;in addition,polysaccharide from rhizome of Alocasia macrorrhiza was composed by D(+)-mannose,D-Galacturonic acid,D(+)-glucose,D(+)-galactose,L(+)-arabinose.[Conclusion]The tests establish a steady, convenient extraction technology of polysaccharide from rhizome of Alocasia macrorrhiza and analyse the monosaccharide composition of polysaccharide, which provides a theoretical basis for the reasonable development of Alocasia macrorrhiza.

polysaccharide from Alocasia macrorrhiza(Lour.)Schott;the extraction technology;orthogonal test;optimization;glucose;monosaccharide; pre-column derivatization

R282

A

1005-5509（2017）04-0265-06

10.16466/j.issn1005-5509.2017.04.001

2016-12-08）

浙江省自然科学基金项目(LY15H280004)

Fund project:Zhejiang Provincial Natural Science Foundation(LY15H280004)

钟晓明，E-mail:k6_zxm@sina.com