HPLC法测定傣药材楠果缅(栘木衣树皮)中的槲皮素含量

刘承清 赵应红 李晓幸

(1.西双版纳傣族自治州傣医医院，云南 西双版纳 666100; 2.西双版纳职业技术学院，云南 西双版纳 666100)

楠果缅(栘木衣树皮)为蔷薇科植物云南栘木衣Docynia delavayi(Franch.)Schneid.的干燥树皮，于初春剥取树皮，切片，干燥。傣药材为块片或条状，略弯曲。外表面常呈鳞片状脱落，外表皮颜色成黄棕色或棕褐色，表面粗糙，有时表皮附有白色地衣斑；切面皮部黄棕色至黄褐色，纤维性，呈层片状，体重，质硬，断面不整齐。分布于云南省思茅、西双版纳等地区。生长于海拔400～1800m的山野坡地向阳处。傣药称为“楠果缅”，常备当地傣族人民使用。楠果缅(栘木衣树皮)苦、涩、凉。入水、风、土塔。主要功效有清热解毒，收敛治疮，除风止痛，续筋接骨，风湿骨痛。用于烧、烫伤；疔疮脓肿；皮癣，麻疹，水痘，风疹，湿疹，疥疮出现的皮肤瘙痒；跌打损伤，骨折；风湿病肢体关节肿痛。楠果缅(栘木衣树皮)主要含白杨素、槲皮素、广寄生苷等主要成分[1-3]。目前关于楠果缅(栘木衣树皮)化学成分研究及含量测定的研究报告很少，只有对楠果缅(栘木衣树皮)中的白杨素含量测定。笔者通过采用HPLC法测定傣药材楠果缅(栘木衣树皮)中的槲皮素含量，为控制此傣药材的质量具有重要意义，对下一步研究楠果缅(栘木衣树皮)质量控制提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪(带自动进样器、 二极管陈列检测器、 LC solution 色谱工作站、)；UV-2450紫外可见分光光度计(日本岛津)；JA2003N电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司)；LQ-A10002型电子天平(瑞安市乐祺贸易有限公司)；KDM型调温电热套(山东省鄄城振兴仪器厂)；TA-816型光波炉(中山市天倚电器有限公司)；101-1型电热鼓风干燥箱(上海试验仪器厂)等。

1.2 试药：槲皮素对照品(中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号：100081-201610)；娃哈哈纯净水；甲醇、磷酸为色谱纯，盐酸为分析纯。傣药材栘木衣树皮(批号：20161019)由西双版纳州版纳药业所提供。

2 实验方法与结果

2.1 对照品溶液的制备: 取槲皮素对照品在电热鼓风干燥箱恒温105℃，恒温干燥2小时，放冷，精密称定槲皮素对照品4.4mg，置于100mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀、定容，即为对照品溶液(每1mL含槲皮素对照品0.044mg)即得。

2.2 阴性溶液的制备： 量取适量的甲醇(色谱纯)置烧杯中，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3 供试品溶液的制备： 称取栘木衣树皮粉末(过3号筛)约1g,精密称定，置于150mL圆底烧瓶中，精密量取80%甲醇溶液50mL加入圆底烧瓶中,精密称定重量。加热回流1.5h，冷却，再称定重量，用80%甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取续滤液20mL置于100mL三角锥形瓶中，精密加入25%盐酸溶液7mL，置85℃水浴锅中水解30min，取出，迅速冷却，转移至50mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液用0.45μm微孔滤膜滤过，即得[3]。

2.4 检测波长的选择：精密称取槲皮素对照品一定量，配置成一定浓度的溶液，在200 ～ 700nm处进行波长扫描，结果发现在370nm处吸收峰最大，干扰最少，所以选择370nm为测量吸收峰。

2.5 色谱条件与系统适用性试验: 色谱柱：Kromasil C18柱(4.6×150mm，5μm)；流动相：甲醇-0.5%磷酸(49:51)；柱温：35℃；流速：0.8mL·min-1；检测波长：370nm[5-7]。分别精密吸取对照品溶液、阴性溶液、供试品溶液各10μL注入高效液相色谱仪中,理论板数按槲皮素峰计算不应低于3500。供试品中槲皮素的色谱峰与相邻色谱峰达到基线分离。在此色谱条件下的色谱图见图1。

2.6 方法学考察

2.6.1 线性关系考察:分别精密量取“2.1”项下的槲皮素对照品溶液1mL，2mL，4mL，6mL，8mL，10mL，分别置于10mL容量瓶内，加甲醇稀释至刻度，将以上6个不同质量浓度对照品溶液分别进样10μL，照“2.5”项下色谱条件进行测定含量。以峰面积为纵坐标(Y)，槲皮素对照品进样量为横坐标(X)绘制标准曲线图，得到线性回归方程：Y=49006X-54.918，r=0.9997(n=6)，结果显示，槲皮素对照品溶液进样量在4.4～44μg范围内与峰面积呈良好线性关系，见图2。

2.6.2 精密度试验:精密吸取“2.1”项下制备的槲皮素对照品溶液10μL，照“2.5”项下色谱条件进行测定含量，连续进样6针。结果槲皮素的峰面积RSD为0.07%(n=6)。表明仪器精密度良好。

2.6.3 重复性试验: 取同一批傣药材楠果缅(栘木衣树皮)样品约1g,按照供试品溶液制备方法,制备6份供试品溶液,照“2.5”项下色谱条件进行槲皮素含量测定。结果槲皮素峰面积的RSD为0.59%(n=6),结果显示该方法重复性良好。

2.6.4 稳定性试验:取重复性试验中的一份样品溶液，照“2.5”项下色谱条件分别于0，2，4，8，12，24 h时进样10μL测定其峰面积，按照峰面积计算相对标准偏差(RSD)，结果RSD值为0.92%。显示供试品溶液在24h内稳定性好。

2.6.5 加样回收率试验: 称取已知含量的栘木衣树皮样品粉末9份,每份约 1g,精密称定,分别精密加入不同的浓度槲皮素(4.12599mg/mL5.15749mg/mL、6.18899mg/mL)对照品溶液1mL，照“2.3”项下制备供试品溶液，用0.45μm微孔滤膜过滤后，在“2.5”项下色谱条件进行含量测定，测定其峰面积，计算含量和加样回收率。结果见表1，楠果缅(栘木衣树皮)槲皮素的平均加样回收率为100.19%，RSD为1.31%。

注：与对照组比较，P<0.05

3 样品含量测定

称3批傣药材楠果缅(栘木衣树皮)粉末样品(过三号筛)，每批2份，每份约1g，精密称定，照“2.3”项下制成供试品溶液。精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μL，照“2.5”项下色谱条件注入高效液相色谱仪中，用外标法计算楠果缅(栘木衣树皮)中的槲皮素含量。结果3批楠果缅(栘木衣树皮)样品(批号： 161104、170101、170306中槲皮素平均含量分别为5.3306mg/g、5.1001mg/g 5.2507mg/g。

4 讨论

4.1 此次试验对提取方法时，根据文献报道提取方法有超声提取法[8]、加热回流提取法进行提取[9]，提取时间为1.5h后进行比较，结果表明加热回流提取法提取出的槲皮素的量远远大于超声提取法所提取的。

4.2 通过UV-2450紫外可见分光光度计对槲皮素的波长测定，发现槲皮素在检测波长为254nm、370nm处有最大吸收值，同时在254nm处杂质吸收值大，干扰性强，不适合检测。所以选择在370nm处做为HPLC的检测波长。

4.3 流动相的考察时，选择用甲醇：水；乙腈：水；甲醇：(0.3%、0.4%、0.5%、0.6%)磷酸溶液做流动相的考察系统，确定使用甲醇：0.5%磷酸溶液做为流动相，考察流动相比例50：50、49:51、51:49。最终确定流动相为甲醇：0.5%磷酸溶液(49:51)，进样速度为0.8 mL/min，检测波长为370 nm柱温为35℃条件下进行楠果缅(栘木衣树皮)含量测定，表明槲皮素可分离，并且分离度高，槲皮素峰形达到基线分离，峰形对称。

4.4 槲皮素在傣药材楠果缅(栘木衣树皮)中含量普遍较高，在西双版纳州资源丰富，傣族人民使用广泛，因此槲皮素可适用于傣药材楠果缅(栘木衣树皮)的含量测定及质量控制，同时可作为西双版纳州傣医院处方制剂中质量控制成分及其应用提供一定的参考依据。

[1]郑进,林艳芳.傣药学[M].北京：中国中医药出版社，2007，94.

[2]林艳芳，依专，赵应红.中国傣医药彩色图谱[M].昆明:云南民族出版社，2003:545.

[3]云南省中药材标准.第三册.傣族药[S].昆明:云南科技出版社，2005,291-303.

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典(四部)[S].北京：中国医药科技出版社，2015.

[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：中国医药科技出版社，2015.127.

[6]谢紫薇，李强，刘珊.高效液相色谱法同时测定芒果叶中芦丁与槲皮素含量[J].中国药业，2016，25(21)：35.

[7]尹玲，冯芸，吴珊，等.HPLC法测定菝葜提取物中槲皮素的含量[J].中国药房，2010,21(35)：3313.

[8]宋伟峰，罗淑媛，李瑞明，梁耀荣.HPLC测定柚寄生中槲皮素的含量[J].药品鉴定，2012,19(28)：65-68.

[9]陈健.高效液相色谱法测定金钱草片中的槲皮素和山奈素含量[J].中国药业，2016，25(6)：62-63.