高等级生物安全实验室生物反应器加样过程风险识别与控制

孟轲音，王承宇，钱军，郭振东，田圆，郝镯，李楠，万忠海

高等级生物安全实验室生物反应器加样过程风险识别与控制

孟轲音，王承宇，钱军，郭振东，田圆，郝镯，李楠，万忠海

目的：对生物反应器在高等级生物安全实验室加样操作过程中的风险加以识别，并通过设备的改进加以防范控制。方法：研究设计了生物反应器用加样口针头封闭器，并通过激光粒子计数器进行检漏。结果：制作了生物反应器用加样口针头封闭器，通过激光粒子计数器对加样口周围环境进行检测，与环境本底比较未见气溶胶粒子检出。结论：在高等级生物安全实验室采用本研究设计的生物反应器用加样口针头封闭器既能简便操作，又能有效防止此环节中病原微生物的泄漏，从而保证了操作人员及实验室内环境的生物安全。

高等级生物安全实验室；生物反应器；风险识别与控制

生物反应器是指利用生物体所具有的生物功能，通过生化反应或生物自身的代谢获得目标产物的装置系统，因其具有产量高、成本低、密封性强及污染少等优点，被诸多领域的科学工作者广泛应用。目前，利用生物反应器代替转瓶进行细胞规模化培养已成为现代生物技术发展的趋势，而规模化培养的细胞通常又是作为病毒或细胞产品的底物[1-2]。故对生物反应器在使用过程中的风险识别与防范显得尤为重要，尤其是在从事烈性病原研究的高等级生物安全实验室。本实验设计主要是为了解决德国SARTORIUS公司生产的15L搅拌型生物反应器在国产化高等级病原微生物模式实验室进行病毒接种加样过程中存在的安全隐患问题。研究表明，此生物反应器在病毒接种加样过程中存在以下两个风险点：一是加样口加入病毒培养液后，针头拔出隔膜时，液体会残留在隔膜上，暴露在空气中；残留在针头上的病毒液也存在暴露在室内的危险；二是注射器注入病毒液和拔出的过程中也存在产生气溶胶的风险。为了解决以上两个问题，本实验室研究设计了一种新型加样口针头封闭器，采用此封闭器，加样前后，针头均装置在封闭的筒体中，即使加样后针头拔出时带有残留液体，也能封存在筒体中，不会与外界接触，从而保证针头上的培养液不会扩散到外部，大大规避了风险，降低了操作中的风险系数，同时也简便了操作。

1 资料和方法

1.1 主要仪器设备德国SARTORIUS公司生产的15L搅拌型生物反应器；美国TSI306-V2型激光粒子计数器。

1.2 研究方法

1.2.1 病毒接种加样口的风险识别此生物反应器加样口加样时为了避免病毒液在环境中暴露时间过长，污染环境，需两人配合快速操作。首先，一人打开加样口，拿酒精棉对加样口胶垫进行消毒，随后在消毒后的加样口周围放一圈酒精棉；另一人快速将预先放置于酒精棉中的接毒器拔出插入隔膜注入病毒，然后用一部分酒精棉消毒拼接样口，用剩余的酒精棉与接毒器一起拔出装入锐器盒后放入高压灭菌袋，待高压灭菌处理。操作过程见图1。

图1 操作过程

1.2.2 加样口针头封闭器的设计为了解决在加样过程中的病毒泄漏问题，我们设计了加样口针头封闭器。此针头封闭器由针头1、右端盖2、筒体3、连接盖4、密封盖5及橡胶垫6、8构成，筒体的一端通过螺纹连接有右端盖及橡胶垫，右端盖的中部设有针孔9；筒体的另一端通过螺纹连接有橡胶垫、连接盖，连接盖的中部设有中间孔7，密封盖通过橡胶垫扣在连接盖的另一端，构成封闭的筒体结构。其整体结构原理图见图2，筒体结构原理图见图3。

1.2.3 防漏效果检测方法防漏检测在环境温度为19℃，相对湿度为40%，负压值为-60 Pa的实验室里进行。采用激光粒子计数器分别对生物反应器病毒模拟实验加样前后加样口周围环境进行检测。程序设置为每隔4 s分别测试200 s（50 t），记录各时间段的粒子数，测试数据通过t检验法进行统计学分析[3]。

图2 整体结构原理图

图3 筒体结构原理图

2 结果

2.1 制作了加样口针头封闭器首先将针头与此封闭器装配好，高压灭菌后待用；加样时，先将针头从连接盖的中间孔扎出，再扎入加样口，并将连接盖与反应器的加样口拧紧，使本封闭器固定在加样口上，进行加样；加样完成后，将针头与连接盖分离，直接退回到密封的筒体内，并将连接盖与反应器的加样口分离，将密封盖扣在连接盖上将筒体密封，完成生物反应器的加样。加样口针头封闭器与针头连接实物图见图4。

图4 加样口针头封闭器与针头连接实物图

2.2 激光粒子计数器检测分析结果通过t检验法进行统计学分析，加样前后加样口周围气溶胶数量比较，[（7.560×103/L）VS.（7.490×103/L），P= 0.28]，差异不显著。

3 讨论

近年来，世界各地频频暴发突发性公共卫生事件，2003年发生在我国大范围的SARS、2004年发生在泰国等地的禽流感以及2014年发生在西非的埃博拉疫情，都给人类社会造成了巨大的生命和财产损失，因此对上述烈性病毒、病原体的系列研究迫在眉睫[4-5]。研制出相应烈性病毒、病原体的疫苗仍是解决此问题的行之有效的办法。利用规模化生产的细胞接种病毒又是实现这一目标的有效手段。上述烈性病原的研究需在高等级生物安全实验室内进行。高等级生物安全实验室的生物安全工作是一项很重要的工作，而风险评估又是生物安全工作的核心。风险评估包括病原微生物特征的风险评估和实验活动的风险评估[6-9]。国内外有关高等级生物安全实验室风险评估的研究已有相关报道，但在高等级生物安全实验室中利用生物反应器开展细胞规模化培养并接种病毒过程的风险评估报道较少。

本项目主要是研究在高等级生物安全实验室模拟病毒在试验和生产过程中的风险识别与控制。本研究主要是对生物反应器加样过程中的风险加以识别，并通过设备的改进加以控制。改进后的设备在加样过程中一个人即可独立完成，且全程操作处在封闭状态下进行，尽可能的避免了因人员配合不当、注意力不集中或操作意外等不可抗力造成的风险。同时，也对改进后加样操作过程中能否产生气溶胶进行了检测并做了统计差异分析。分析结果表明加样后没有气溶胶粒子扩散至加样口周围环境中。我们在做此项研究的同时，也为使用同种型号，从事相关研究，面临同样问题的同行提供一个参考。

[1]张前程，张凤宝，姚康德，等.动物细胞反应器研究进展[J].化工进展，2002，21（8）：560-563.

[2]骆海燕，窦冰然，姜开维，等.搅拌式动物细胞反应器研究应用与发展[J].生物加工过程，2016，14（2）：75-80.

[3]吴佳，宋冬林，唐浩，等.BSL-3实验室内气溶胶扩散实验研究[J].中国预防医学杂志，2013，14（2）：157-159.

[4]Frieden T R.Review of CDC anthrax lab incident [EB/OL].http://www.cdc.gov/washington/testimony/2014/t20140716.htm.

[5]Hottes AK，Rusek B，Sharples F.Biosecurity challenges of the global expansion of high-containment biological laboratories[M].Washington，DC：National Academies Press，2012.

[6]中华人民共和国卫生部.人间传染的病原微生物名录[EB/OL].2006.

[7]中华人民共和国国务院.病原微生物实验室生物安全管理条例[EB/OL].2004.

[8]实验室生物安全通用要求[EB/OL].(GB19489-2008)

[9]实验室生物安全手册.世界卫生组织（第3版）.2004.（收稿：2016-12-25修回：2017-01-30编校：齐彤）

Risk identification and control of samples adding in bioreactor from high-level bio-safety laboratories

MENG Ke-yin，WANG Cheng-yu，QIAN Jun，GUO Zhen-dong，TIAN Yuan，HAO Zhuo，LI Nan，WANZhong-hai
.Institute of Military Veterinary，Academy of Military Medical Sciences，Key Laboratory of Jilin Province for Zoonosis Prevention and Control，Jilin Changchun 130122，China Corresponding author：WAN Zhong-hai，E-mail：wzhyjs531@163.com

Objective：Identify the risk of samples adding in bioreactor from high-level bio-safety laboratories，then control by improving equipment.Methods：Design a syringe needle closure that is applied to the mouth samples adding and detect the leak with a laser ion counter.Results：Compared with background environment，there is nothing aerosol particles to be detect in air.Conclusion：Using of the syringe needle closure can not only simplify the operation but also prevent the leak of pathogenic microorganism, to make sure the safety of operating personnel and environment.

high-level biosafety laboratories；bioreactor；risk identification and control

Q

A

2095-3496（2017）01-0005-03

10.19372/j.cnki.issn.2095-3496.2017.01.002

国家科技部重点研发项目（2016YFC1202303）

130122吉林长春，军事医学科学院十一所，吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室（孟轲音，王承宇，钱军，郭振东，田圆，郝镯，李楠，万忠海）

万忠海，E-mail：wzhyjs531@163.com