红景天苷对糖尿病肾病大鼠的治疗作用及其机制探讨

朴敏虎，王程瑜，李香丹，杨莎莎，崔逢德，许东元

(1延边大学附属医院，吉林延吉133002；2延边大学医学院)

红景天苷对糖尿病肾病大鼠的治疗作用及其机制探讨

朴敏虎1，王程瑜2，李香丹2，杨莎莎2，崔逢德2，许东元2

(1延边大学附属医院，吉林延吉133002；2延边大学医学院)

目的 观察红景天苷对糖尿病肾病(DN)大鼠的治疗作用，并探讨其作用机制。方法 将24只大鼠随机分为对照组、DN组和治疗组，每组8只。治疗组和DN组腹腔注射链脲佐菌素制备DN模型，造模成功后分别给予红景天苷及等量生理盐水灌胃；对照组腹腔注射等量柠檬酸缓冲液，并给予等量生理盐水灌胃。连续灌胃10周后，腹主动脉采血检测血糖、血尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)；处死后取肾组织，采用分光光度法检测肾组织中的SOD和MDA，免疫印迹法检测肾组织中磷酸化的蛋白激酶B(Akt) 和糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)蛋白。结果 与对照组相比，DN组血糖、BUN、Scr、IL-1β、TNF-α水平和肾组织中MDA活性升高，而肾组织中SOD活性及Akt、GSK-3β蛋白磷酸化水平降低(P均<0.05)；与DN组相比，治疗组血糖、BUN、Scr、IL-1β、TNF-α水平和肾组织MDA活性降低，而肾组织中SOD活性及Akt、GSK-3β蛋白磷酸化水平增加(P均<0.05)。结论 红景天苷可能通过活化Akt/GSK-3β信号通路，控制血糖、炎症和氧化应激反应，从而对DN发挥治疗作用。

糖尿病肾病；红景天苷；蛋白激酶B；糖原合成酶激酶3β；炎性因子；氧化应激；大鼠

糖尿病肾病(DN)是糖尿病的一种严重并发症，是糖尿病患者主要死因之一。糖尿病患者由于胰腺功能障碍或胰腺损伤引起胰岛素的缺乏，导致血糖增高，组织缺氧，进而诱导炎性细胞因子释放，激活氧化应激反应，从而造成细胞凋亡，最终导致肾小球硬化、肾功能不全[2]。蛋白激酶B/糖原合成酶激酶3β(Akt/GSK-3β)是调控炎性反应的重要通路，其磷酸化程度可表示其活性高低。最近研究调查表明，30%的1型糖尿病患者和20%的2型糖尿病患者可发展成DN导致终末期肾病(ESRD)，而我国糖尿病患者中2型糖尿病DN患病率达34.7%[2,3]。红景天苷是红景天的一种主要成分，可以降低血糖[4]、抗炎、抗氧化[5]，对糖尿病有一定的治疗作用。2014年12月～2016年6月，我们制备DN大鼠模型，观察红景天苷对DN的治疗作用，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 健康SD雄性大鼠24只，体质量200～250 g，购于延边大学实验动物中心，清洁级，常规室温分笼饲养，自由饮水。链脲佐菌素(STZ)购自Sigma 公司；红景天苷和细胞裂解缓冲液(RIPA)购自北京索来宝生命科学公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司。Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β、β-actin兔抗鼠一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购于Santa Cruz公司。主要仪器有血糖仪(强生Sure Step Plus)、全自动生化分析仪和F50型酶标仪(瑞士Tecan公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组与给药处理 将大鼠随机分为对照组、DN 组、治疗组，每组8只。其中治疗组和DN组腹腔注射STZ 60 mg/kg(溶于0.1 mol/L柠檬酸缓冲液)以诱导DN，对照组给予等量柠檬酸缓冲液，并收集24 h尿液。72 h后，通过尾静脉采血，测量血糖，并检测24 h尿蛋白。大鼠血糖水平均﹥16.7 mmol/ L、尿蛋白≥30 mg/(kg·d)，确认DN模型成功。治疗组大鼠用红景天苷100 mg/(kg·d)灌胃10周，剩余两组给予等量生理盐水灌胃，治疗期间实验动物供给基本饮食。

1.2.2 血糖、肾功能及血清炎症因子检测 治疗10周后，腹主动脉取血，15 000 r/min离心10 min，取血清，按照试剂盒操作方法利用全自动生化分析仪测定血糖、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)；按照ELISA检测试剂盒操作说明,通过酶标仪测定血清IL-1β和TNF-α水平。

1.2.3 肾组织氧化应激标记物检测 采血后处死大鼠，摘取肾组织，部分甲醛固定，部分冻存。取部分肾组织，匀浆后以3 000 r/min离心15 min，取上清液，按试剂盒操作说明利用紫外分光光度计测定MDA含量和SOD的活性，。

1.2.4 肾组织Akt/GSK-3β通路磷酸化水平测定 取冻存的肾组织约100 mg，添加RIPA和苯甲磺酰氟(PMSF)后充分匀浆，并在4 ℃环境下静置30 min。然后经100 ℃煮沸5 min变性，迅速转移到4 ℃ 环境中静置1～2 min，再离心10 min(13 000 r/ min，4 ℃)。取离心后的上清液，用BCA试剂通过比色法进行蛋白定量。提取的蛋白质经SDS-PAEG胶分离并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，加相关一抗Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β、β-actin 4 ℃孵育过夜，再经相应的辣根过氧化物酶孵育2 h。最后通过ECM试剂盒在暗室曝光，所显示的条带经IPP软件测量其灰度值进行统计学分析。以目的蛋白与β-actin灰度值比值表示目的蛋白表达量，以p-Akt/Akt、p-GSK-3 /GSK-3 表示Akt/GSK-3β通路磷酸化水平。

2 结果

2.1 各组大鼠血糖及肾功能比较 见表1。

表1 各组大鼠血糖及肾功能比较±s)

注：与对照组比较，*P<0.05；与DN组比较，#P<0.05。

2.2 各组大鼠血清IL-1β、TNF-α水平及肾组织MDA、SOD活性比较 见表2。

表2 各组大鼠血清IL-1β、TNF-α水平及肾组织MDA、SOD活性比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与DN组比较，#P<0.05。

2.3 各组大鼠肾组织Akt/GSK-3 通路磷酸化比较 见表3。

3 讨论

糖尿病患者的主要死因是多个组织器官的并发症，其中包括DN。DN是以肾小球小动脉硬化为主要病变，而氧化应激与糖尿病微血管病变有关。糖尿病患者体内自由基清除系统明显受损，机体产生大量氧自由基[6]。有研究表明，氧化应激时过多产生的活性氧簇通过多种信号通路介导炎症因子、趋化因子及黏附因子的释放，作用于肾脏细胞继而发生DN[7]。

表3 各组大鼠肾组织Akt/GSK-3 通路磷酸化水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与DN组比较，#P<0.05。

红景天苷是红景天的主要有效成分，具有降血糖、抗炎、抗氧化等多种药理作用[4,5]。本研究通过STZ诱导制备的DN大鼠模型，观察红景天苷的抗炎和抗氧化作用机制。结果显示，红景天苷明显降低血糖水平，这与之前的研究结果基本一致[8，9]。TNF-α、IL-1是两个重要的促炎细胞因子，是促进炎症反应的两大主要物质[10]。TNF-α主要由巨噬细胞产生，并通过特定的细胞膜受体发挥作用。IL-1是由有核细胞产生，包括IL-1α和IL-1β。IL-1β和抗原呈递细胞共同刺激T细胞和B细胞的增殖、分化，并诱导全身性炎症反应。本实验中发现，红景天苷能降低血清IL-1β、TNF-α的水平，表明红景天苷具有抗炎作用。SOD是一种清除生物体内超氧阴离子自由基的抗氧化酶；而MDA是氧自由基和膜不饱和脂肪酸的过氧化产物，可破坏细胞膜，改变其流动性和膜渗透性。本研究中我们观察到红景天苷可以提高活性氧的清除能力，提高SOD活性，降低MDA的产生。PI3K/Akt信号通路是一个重要的细胞内信号转导途径，参与细胞凋亡、蛋白质合成、葡萄糖运输、血管生成和其他重要的生理功能的调节[11～13]。GSK-3β在调控促炎因子与抗炎因子生成的平衡中起重要作用[14]，Akt激活后可以磷酸化GSK-3β，进而调节转录因子CREB、NF-κB与cAMP反应元件结合蛋白的能力，最终调控相关细胞因子的合成。已有研究表明，红景天能够通过激活PI3K/Akt/GSK-3β信号通路，增加脂肪组织Akt和GSK-3β磷酸化，进而降低血糖。本研究发现，红景天苷治疗后可以使DN大鼠肾组织中GSK-3β和Akt磷酸化增加，表明红景天苷能够通过激活Akt/GSK-3β通路引起Akt的磷酸化水平升高，进而磷酸化GSK-3β，从而抑制炎症因子的生成和氧化应激反应，起到减轻肾组织损伤的治疗作用。

[1] Kanwar YS, Sun L, Xie P, et al. glimpse of various pathogenetic mechanisms of diabetic nephropathy[J]. Annu Rev Pathol, 2011,6(1):395-423.

[2] 中华医学会糖尿病分会.中国2型糖尿病防治指南(2013正式版)[J].中华糖尿病杂志，2014,30(8)：450.

[3] Collins AJ, Foley RN, Herzog C, et al. Us renal data system 2010 annual data report[J]. Am J Kidney Dis, 2011,57(Suppl 1):A8,e1-526.

[4] Li F, Tang H, Xiao F, et al. Protective effect of salidroside from Rhodiolae radix on diabetes-induced oxidative stress in mice[J]. Molecules, 2011,16(12):9912-9924.

[5] Zhang MF, Shen YQ. Anti-inflammation, anti-tumor and immunoregulation of salidroside and its aglycone tyrosol[J]. Drug Evaluation Research, 2013, 56(3), 228-234.

[6] 李玲华,袁少静,刘杰,等.复方红景天对2 型糖尿病肾病大鼠尿微量白蛋白、血晚期氧化蛋白产物水平的影响[J].山东医药,2015,55(21)：23-25.

[7] 赵芳芳,王季猛,程灿.糖尿病肾病发病机制研究进展[J].现代生物医学进展,2010,10(24)：4796-4798.

[8] 吕翠,刘洪娟,刘晓丽,等.晚期糖基化终末产物受体及其抑制剂的研究进展[J].中国药理学通报,2013,29(4)：452-456.

[9] 金秀男,宋百慧,贾彦均,等.红景天乙醇提取液对实验性糖尿病大鼠血糖及肾脏结构变化的影响[J].延边大学医学学报,2009,32(4):241-243.

[10] Chen J, Liao MY, Gao XL, et al. IL-17A induces pro-inflammatory cytokines production in macrophages via MAPKinases, NF-κB and AP-1[J]. Cell Physiol Biochem, 2013,32(5):1265-1274.

[11] Shinya T, Tetsuji M, Reiko T, et al. Cardioprotection induced by olprinone, aphosphodiesterase Ⅲ inhibitor, involvesphosphatidylinositol-3-OH kinase-Akt and a mitochondrial permeability transition pore during early reperfusion[J]. J Anesth, 2006,21(2):177-188.

[12] Zhu Yi, Pereira RO, O′Neill BT, et al. Cardiac PI3K-Akt impairs insulin-stimulated glucose uptake independent of mTORC1 and GLUT4 translocation [J]. Mol Endocrinol, 2012,27(1):172-184.

[13] 朱美霞，刘晓霞，康娅，等.罗布麻总黄酮通过PI3K/Akt/GSK3β抑制H2O2诱导的EA.hy926 凋亡机制研究[J].生命科学研究,2016,20(2):145-152.

[14] Russo A, Schmid E, Nurbaeva MK, et al. PKB/SGK-dependent GSK3-phosphorylation in the regulation of LPS-induced Ca2+increase in mouse dendritic cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2013,437(3):336-341.

国家自然科学基金资助项目(81460056)。

许东元(E-mail： dyxu@ybu.edu.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.10.010

R587.1

A

1002-266X(2017)10-0034-03

2016-11-12)