TRIM28在结直肠癌组织中的表达及其对癌细胞增殖、迁移能力的影响

马素珍，潘晓丽，张方方，刘丹丹，石宁，郝万清，朱艳琴

(河南中医药大学，郑州450008)

·基础研究·

TRIM28在结直肠癌组织中的表达及其对癌细胞增殖、迁移能力的影响

马素珍，潘晓丽，张方方，刘丹丹，石宁，郝万清，朱艳琴

(河南中医药大学，郑州450008)

目的 观察三结构域蛋白家族(TRIM)28在结直肠癌组织中的表达情况及其对癌细胞增殖、迁移能力的影响。方法 采用免疫组化法检测145例结直肠癌及其相应癌旁组织中的TRIM28，分析其与结直肠癌患者临床病理特征及生存预后的关系。将结直肠癌HT29细胞随机分为观察组和对照组，分别转染shTRIM28降表达质粒、空载对照质粒48 h，采用Western blot法检测HT29细胞中的TRIM28，分别采用MTT法和细胞划痕实验观察HT29细胞的增殖及迁移能力。结果 结直肠癌组织中TRIM28高表达97例，高于癌旁组织中的4例(P<0.01)；并且，存在淋巴结转移、远处转移及Dukes分期高者TRIM28表达水平高于无淋巴结转移和远处转移及Dukes分期低者(P均<0.05)。TRIM28高表达者3年无病生存率为68.0%,低于TRIM28低表达者的83.3%(P<0.01)；COX比例风险模型多因素分析结果显示，TRIM28表达是结直肠癌患者独立的预后因素(HR=3.26，P=0.01)。观察组HT29细胞中TRIM28相对表达量低于对照组(P<0.01)，且观察组细胞增殖OD值及迁移距离均小于对照组(P均<0.01)。结论 TRIM28在结直肠癌组织中高表达，降低其表达可抑制结直肠癌细胞的增殖及迁移；其在结直肠癌的发生发展中起重要作用，可作为结直肠癌患者的预后指标和潜在治疗靶点。

结直肠癌；三结构域蛋白家族；临床病理指标；生存预后；细胞增殖；细胞迁移

目前，结直肠癌发病率依然迅速上升，呈年轻化趋势，严重威胁人类的生命健康[1]。虽然，肿瘤治疗的方法有了较大进步，但患者总生存期和无病生存期改善不显著，所以寻找有效的治疗靶点迫在眉睫。大量研究显示，三结构域蛋白家族(TRIM)在肿瘤发生发展过程中起重要作用[2,3]。TRIM28也称KAP1或TIF1β，由于它能与含有锌指蛋白的转录因子家族蛋白相互作用，所以TRIM28被认为是通用转录共抑制因子[4]。有文献报道，TRIM28可以抑制p53活性从而增强细胞对DNA损伤的敏感性，而且TRIM28还能抑制E2F1的转录及其促凋亡功能的发生[5]。TRIM28已经被证实与多种肿瘤有关，但尚未见TRIM28表达与结直肠癌关系的报道。本研究通过检测TRIM28在结直肠癌组织中的表达，分析其在结直肠癌发生发展中的生物学功能，并在结直肠癌细胞中进行验证。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取河南中医药大学第一附属医院2006年1月～2010年12月145例结直肠癌患者手术切除的组织标本，包括结肠癌组织和对应癌旁组织(距离肿瘤﹥5 cm)。患者术前均未行化疗及放疗，所有肿瘤组织标本经病理证实为结直肠腺癌，癌旁组织证实无癌细胞转移浸润。其中，男82例，女63例；年龄37～84岁，中位年龄61岁；高、中分化腺癌94例，低分化腺癌51例；浸润深度T1～T241例，T3～T4104例；Dukes临床分期A期29例，B期60例，C期39例，D期17例；发生淋巴结转移92例，远处转移17例。

1.2 结肠癌和癌旁组织中TRIM28检测 采用免疫组化法。一抗TRIM28兔多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，免疫组化专用一抗稀释液、辣根过氧化物酶标记通用二抗(PV-6000)及DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，免疫组织化学染色采用SP二步法。抗体稀释液1∶100稀释一抗TRIM28，4 ℃孵育过夜；免疫组化通用二抗室温孵育1 h，DAB显色2 min。免疫组化结果判断：细胞核被染成颗粒状黄褐色为阳性细胞，阳性细胞百分比<50%为低表达，≥50%为高表达。

1.3 结肠癌细胞培养及降表达TRIM28细胞系的构建 将结肠癌细胞株HT29加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，于37 ℃、5% CO2饱和湿度的恒温培养箱中培养。将TRIM28降表达序列TCTGTTCTCTGTCCTCTCGAGAGGACAGAGAACAGAGC

CAGG装入载体pLK0.1，构建shTRIM28降表达质粒，空载体作为对照质粒；然后分别将两种质粒转染293T细胞，48 h后收集病毒感染HT29细胞，嘌呤霉素筛选后获得稳定降表达TRIM28的细胞系(观察组)和对照细胞系(对照组)。

1.4 结肠癌细胞中TRIM28检测 采用Western blot法。RIPA裂解液提取两组细胞的蛋白，应用BCA法测量蛋白浓度并均一；SDS-PAGE凝胶电泳90 min，Bio-Rad装置湿转蛋白于PVDF膜上，17 mA转膜过夜；切取含目的条带的PVDF膜，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h。孵育TRIM28抗体(1∶2 000)与β-actin内参抗体(Santa Cruz公司，1∶5 000)4 ℃过夜， TBST洗膜10 min×3次；室温孵育二抗(1∶10 000)1 h，再用TBST洗膜10 min×3次；ECL显影，用Image J软件分析并计算TRIM28相对表达量。

1.5 结肠癌细胞增殖情况观察 采用MTT法。取两组细胞，先用0.05%胰蛋白酶消化，制备成单细胞悬液，以2×103/孔接种96孔板；分别在24、48、72、96、120 h时取出96孔板，每孔加入5 mg/mL 的MTT 20 μL，孵育4 h后弃液；每孔中加入DMSO 150 μL，震荡10 min；用酶标仪于490 nm处检测各孔的OD值，绘制生长曲线。实验重复3次。

1.6 结肠癌细胞迁移情况观察 采用细胞划痕实验。取两组细胞，以5×105/孔接种于6孔板；第2天用枪头划痕(宽约0.5 cm)，PBS清洗脱落的细胞；加入无血清培养基，放入培养箱培养；在0、24、48 h拍照,并测量细胞迁移距离。

1.7 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验，计量资料比较采用单因素方差分析及t检验；单因素生存分析采用Log-Rank检验，多因素分析采用COX比例风险模型。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠癌和癌旁组织中TRIM28表达比较 结直肠癌组织中TRIM28高表达97例、低表达48例，癌旁组织分别为4、141例，结肠癌组织中TRIM28表达高于癌旁组织(χ2=127.45，P<0.01)。

2.2 TRIM28表达与结直肠癌患者临床病理参数的关系 TRIM28表达与患者的年龄、性别、病理分化程度及肿瘤浸润深度没有相关性；但存在淋巴结转移、远处转移及Dukes分期高者TRIM28表达水平高于无淋巴结转移和远处转移及Dukes分期低者(P均<0.05)。见表1。

表1 TRIM28表达与结直肠癌患者临床病理参数的关系

2.3 TRIM28表达与结直肠癌患者生存预后的关系 随访截止2015年12月31日，TRIM28高表达者3年无病生存率为68.0%,显著低于TRIM28低表达者的83.3%(P<0.01)。多因素分析显示，肿瘤Dukes分期、浸润深度、淋巴结转移、TRIM28表达是结直肠癌患者独立的预后因素。见表2。

表2 影响结直肠癌患者生存预后的多因素分析结果

2.4 两组结直肠癌细胞TRIM28表达量比较 观察组结直肠癌细胞中TRIM28相对表达量为0.15±0.02，低于对照组的0.89±0.05(P<0.01)。

2.5 沉默TRIM28表达对结直肠癌细胞增殖的影响 两组结直肠癌细胞增殖的OD值比较,见表3。

表3 两组结直肠癌细胞增殖的OD值比较±s)

注：与对照组同时点比较，*P<0.05，#P<0.01。

2.6 沉默TRIM28表达对结直肠癌细胞迁移的影响 观察组结直肠癌细胞迁移距离为(0.09±0.02)mm，低于对照组的(0.53±0.10)mm(P<0.01)。

3 讨论

TRIM28蛋白具有一个N-末端的三重模体结构，该结构包含1个锌指结构、2个B-boxes盒和1个卷曲螺旋结构域[6]。TRIM28首先通过含有KRAB结构域的锌指蛋白被招募到染色质上，进而作为支架蛋白进行蛋白质修饰和泛素化。因此，在表观遗传方面，TRIM28通过多个转录共抑制复合物调控基因的表达[7]。研究[8]发现，TRIM28在胚胎发育、调节细胞干性、调控细胞分化、DNA损伤修复等多个生理方面发挥着重要的作用。

在细胞实验中发现，TRIM28高表达可促进肿瘤的发生和转移。在乳腺癌细胞系中，TRIM28表达显著升高[9]。在临床试验中，也有许多研究发现TRIM28同样参与了肿瘤的发生和进展。TRIM28高表达与宫颈癌转移有关[10]，是腹膜转移癌的独立预后因素[2]；TRIM28高表达可能与胃癌和甲状腺癌的临床分期有关[11,12]，与早期肺癌的预后有关[13～15]；此外，TRIM28在胰腺癌中高表达，且与癌细胞侵袭有关[16,17]。但是，尚未见TRIM28表达与结直肠癌关系的报道。

在对结直肠癌的研究中，我们得到了与其他肿瘤相似的结论，TRIM28高表达与结直肠癌的发生发展密切相关。我们首先采用免疫组化法检测TRIM28在结直肠癌及相应癌旁组织中的表达水平，结果显示TRIM28在结直肠癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织，提示REIM28高表达与结直肠癌的发生有关。而且，TRIM28表达水平越高，结直肠癌越容易发生淋巴结转移和远处转移，高表达TRIM28的肿瘤Dukes分期较高，提示TRIM28与结直肠癌的恶性进展密切相关。此外，我们通过对145例结直肠癌患者的随访，发现TRIM28高表达者预后较差，而且TRIM28是结直肠癌患者独立的预后因素。在分子生物学研究中，常通过过表达或沉默基因来研究其生物学功能。在本研究中，我们利用shRNA沉默TRIM28的表达，观察TRIM28对结直肠癌细胞增殖和转移的影响。结果发现，沉默TRIM28后结直肠癌细胞的迁移能力显著降低，这与我们在组织中发现的TRIM28高表达患者更易发生转移一致。以上结果提示，TRIM28在结直肠癌发生发展过程中功能的发挥，主要是影响细胞的增殖、迁移能力。另外，研究[5,9,10,13]也发现TRIM28高表达与卵巢癌、肺癌、宫颈癌和乳腺癌等肿瘤的转移相关。

综上所述，我们认为TRIM28在结直肠癌发生发展过程中起着重要作用，而且TRIM28可作为结直肠癌患者的独立预后指标；并且，TRIM28在多种肿瘤中发挥着重要作用，TRIM28高表达具有一定的普遍性，有可能作为肿瘤靶向生物治疗的潜在靶点。

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河南省高等学校重点科研项目(16A310021)。

朱艳琴(E-mail: jc.zyqin@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.10.008

R735

A

1002-266X(2017)10-0028-03

2016-06-17)