液相色谱–串联质谱法测定蔬菜中2种极性农药残留量

刘益山 许凌成都市成华区疾病预防控制中心 （四川 成都610051）

液相色谱–串联质谱法测定蔬菜中2种极性农药残留量

刘益山 许凌＊成都市成华区疾病预防控制中心 （四川 成都610051）

建立同时测量百草枯、单甲脒2种极性农药的液相色谱—串联质普测定方法，采用SCX和C18（质量比为1:20）复合材料的Shiseido CAPCELL PAK CR色谱柱分离，最后采用高压液相色谱—串联质谱仪检测。对质谱条件及色谱条件进行优化处理，蔬菜样品采用甲酸—乙腈溶液均质进行提取，三氯甲烷去除色素，并在定量限1、20、10倍浓度水平处理，其中百草枯回收率在61.8%～97.0%，单甲脒62.2%～100.0%，且测定结果的相对标准偏差≤5.61%。该方法简单快速，可用于蔬菜极性农药中百草枯、单甲脒等残留量的测定。

百草枯 单甲脒 蔬菜 液相色谱—串联质普法 极性农药残留

农药残留是在农业生产过程中一部分农药在使用过程中直接或间接残存于农作物以及土壤或水体中[1]。蔬菜中较为常见的6种极性农药依次分为两大类，一类是常见的季铵盐类农药，代表极性农药为百草枯、敌草快、矮壮素、缩节胺，此类农药易溶于水，在碱性条件下化学性质极不稳定[2～3]；另一类代表农药为单甲脒、灭蝇胺[4]，两者属于强碱极性阳离子有机化合物，属易溶于水等极性溶液，极性农药热稳定好，不易挥发[5～6]。

百草枯化学名1-1，二甲基-4-4-联吡啶阳离子盐，因具有一定的内吸作用及触杀作用，可迅速被植物绿色部位快速吸收并枯萎，是用量仅次于草甘膦的全球第二大除草剂，但该农药对非绿色组织没有作用，经喷洒后虽能迅速与土壤结合钝化，但对植物根部、宿根等无效。大鼠等动物实验显示具有极高致死率，成人预计致使量为40mg/kg，因百草枯可通过皮肤、呼吸道、消化道等进入机体产生危害；单甲脒化学名N-（2,4-二甲基苯）-N’甲基甲脒盐酸盐，具有相当强的杀蚜活性，在柑橘、苹果、棉花等作物有效预防棉蚜，故需进行紧密检测，保证质量安全。目前蔬菜百草枯残留量检测法是紫外线分光光度法，但该方法不具有专属性，且操作较为复杂，受基质干扰多，而蔬菜中残留农药并非百草枯一种，故大多数研究者倾向于液质联用技术测定食品中农药残留量，对极性残留农药采取离子对试剂或亲水色谱柱进行色谱分离，在复杂机制样品农药残留分析中具有独特优势。本研究采用SCX和C18复合位固定相的反相色谱柱分离后再进行色谱分离，可避免亲水色谱柱高浓度缓冲盐影响质谱灵敏度，以此建立蔬菜中极性农药残留量的快速测定法，具体实验步骤如下。

1.实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液质联用仪：TSQ—Quantiva型，配有ESI离子源，由美国Waters科技有限公司生产；

高速组织匀浆机：IKA—T25型，由德国IKA公司生产；

超纯水机：Milli—Q型，由美国Millipore公司生产；

涡旋混匀器：Vortex—Genie 2型，美国Scientific Industries公司生产；

常速离心机：TDL—5—A型，上海安亭公司生产；

高速离心机：5430R型，德国Eppendorf公司生产；

百草枯、单甲脒标准物质：由德国Dr.Ehrenstorfer公司生产；

乙腈、甲醇：色谱纯，纯度≥99.9%，由德国Merck公司生产；

三氯甲烷、乙酸烷：色谱纯，上海安普公司生产；实验用水由Milli—Q超纯水机获得。

混合标准溶液：分别称取百草枯、单甲脒标准样品各10mg于10ml容量瓶中并溶解，制得1.0mg/mL标准储备液，置于-18˚C冷藏、标准中间液用水稀释储存备用液至适当浓度备用。

甲酸—乙腈提取液：分别量取50mL甲酸，加入250ml乙腈，并用清水溶解至1000 mL，注意要现配现用。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件：色谱柱：Shiseido CAPCELL PAK CR柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）；柱温：30˚C；流动相A是99%乙腈，B为乙酸铵（含0.1%甲酸），梯度洗脱程度见表1。

1.2.2 质谱条件

正模式扫描：选择反应监测（SRM）；毛细管电压：3500V；雾化气压力：276 KPa（20 psi）；离子传输管温度：350˚C；雾化气温度：400˚C。百草枯：母离子171.0，子离子与母离子构成定量离子对为77.1/155.125，碰撞能量38、32eV，透镜电压71V；单甲脒：母离子163.05，子离子与母离子构成定量离子对为107.15/122.175，碰撞能量27、18eV，透镜电压49V。

1.3 试验方法

称取试样10.0g于50mL离心管中，并加入10mL甲酸—乙腈提取液。高速匀浆1min，随后加入10mL三氯甲烷，以4500 r/min离心5min，将上层清液全数移至25mL比色管中，残渣中加入10mL甲酸—已经提取液，涡旋提取30s后，以1500r/min离心5min，合并上层清液至25mL比色管，用甲酸—乙腈提取液定容至标线，混合均匀，取1mL甲酸—乙腈提取液于1.5mL离线管中，以15000r/min离心5min，上层清液过0.22 μm滤膜，采用液相色谱—串联质普测定。

表1.梯度洗脱程序

表2.两种农药在蔬菜样品中的线性方程及相关检出限

表3.回收率及精密实验

2.结果与讨论

2.1 质谱条件优化

百草枯属强极性化合物，单甲脒结构中含有氨基结构，两者在质谱离子化时可形成正离子，故进行质谱优化时可使用针泵入1.0μ/mL标准溶液，设定为0.3mL/min的流量，等比例注入流动相A和流动相B，调节质谱源参数，在以及母离子扫描方式下使用化合物的母离子响应值可达最高，在子离子扫描方式下，可通过调节不同的碰撞能量获得较为理想的碎片离子信息，再利用仪器自动优化功能，优化最佳碰撞能量和透镜电压。

2.2 色谱条件的优化

百枯草分子极性较强，在反相色谱柱中难以保存，一般加入七氟丁酸、庚烷磺酸钠等离子对试剂，虽可改善其在反相色谱柱中的色谱行为，同时可造成质谱灵敏度下降，本研究选择CAPCELLPAK CR色谱柱，由SCX和反相C18填料组成固定相；未避免百草枯死吸附现象出现，选择SCX和C18填料为1:20的CR柱，采用含有5 mmol/L的乙酸铵溶液流动相，并优化梯度洗脱程序，显示2种农药分离较为理想，色谱峰型尖锐，未出现干扰峰。

2.3 质普条件的选择

百草枯、单甲脒呈碱性，易溶于水，可采用酸性提取液提取，而蔬菜含色素较多，故采用甲酸溶液均质提取，加入乙腈沉淀纤维，用三氯甲烷除去色素。因两种农药的碱性和极性有一定差异，甲酸溶液的浓度及乙腈的加入量均可影响目标物的提取效率。本次研究通过对两种化合物的回收率为响应值，对甲酸溶液的浓度和乙腈—水比例进行2因素5水平响应面中心组合试验，发现甲酸溶液的浓度及乙腈用量对提取效率均有影响，百草枯回收率较低，乙腈用量和甲酸溶液浓度对其回收率影响不明显，单甲脒随着乙腈用量增加其回收率明显下降，最终确定采用含5%甲酸—乙腈水溶液（体积比25:75）作为本研究的提取液。2.4标准曲线方程和检出限

以上述优化方案对蔬菜试验样品进行加标试验，以待测物信噪比（S/N）为10确定研究方法的定量限。质谱法测定时会有基质效应，百草枯的绝对回收率较低，故本研究采用基质添加匹配标准工作曲线进行定量，两种极性农药的线性范围、线性方程、相关系数、检出限等参数见表2。2.5回收率及精密实验

向阴性蔬菜样品中加入1、2、10倍定量限水平进行回收试验，每个水平可多次重复，取平均值，检测结果见表3。

3.结语

目前针对该类药物的农药检测法包括气相色谱-电子补获检测器（GC-ECD）检测法、液相色谱法、液相色谱法-串联质普法（LC-MS/MS）等方法，因气相色谱-电子补获检测法检测时间长，且检测过程中易受到杂质干扰，而建立液相色谱—串联质谱联用仪检测新鲜蔬菜的残留农药，使用阳离子交换和反相填料的色谱柱进行分离，对季铵盐类极性农药百草枯保留效果较高，且采用甲酸—乙腈水溶液提取，三氯甲烷取出色素，优化研究步骤，提高灵敏度，操作步骤简单。本研究结果显示百草枯在蔬菜样品中绝对回收率低于单甲脒，分析原因可能是百草枯在土壤中容易被钝化，容易受到样品中金属离子影响导致绝对回收率下降。总体来说，该方法具有样品处理简单快速、灵敏度高、测定周期短等优点，可作为食品安全风险监测的检测手段。

[1] 罗赟, 向仲朝, 岳蕴瑶.绵阳市2010-2012年蔬菜、水果和粮食中农药残留量分析[J].现代预防医学, 2014,41(8):1386-1390.

[2] 张庆庆, 王燕燕, 孟品佳.季铵盐类农药残留检测前处理研究进展[J].材料导报, 2014,28(7):85-89.

[3] 张一宾, 钱虹.从百草枯的禁限到含吡啶基除草剂的开发[J].精细与专用化学品, 2016,24(1):11-16.

[4] 王保军, 刘志培, 杨惠芳.单甲脒农药的微生物降解代谢研究[J].环境科学学报, 1998,18(3):296-302.

[5] 杨惠芳, 王保军, 林力, 等.单甲脒农药对土壤微生物种群和土壤酶活性的影响[J].应用与环境生物学报, 1996,2(1):58-65.

[6] 张莉, 桂建业, 赵国兴, 等.固相膜萃取-超声洗脱-原位衍生法分析水中不同极性农药残留[J].分析化学, 2014,42(4):592-596.

1006-6586(2017)04-0018-02

S481.8

A

许凌。