胎衣不下奶牛血清和胎盘中激素含量变化的研究

朱永刚，王磊，王旭荣，张景艳，崔东安，张凯，张康，王学智，李建喜，杨志强

（中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所/甘肃省中兽药工程技术研究中心，兰州 730050）

胎衣不下奶牛血清和胎盘中激素含量变化的研究

朱永刚，王磊，王旭荣，张景艳，崔东安，张凯，张康，王学智，李建喜，杨志强

（中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所/甘肃省中兽药工程技术研究中心，兰州 730050）

本试验在产犊后立即无菌采集32头奶牛血液，其中17头为胎衣正常排出奶牛，15头为胎衣不下奶牛。胎衣正常排出奶牛在胎衣排出后立即采集胎盘，胎衣不下奶牛在确诊后再次静脉采血并采集其胎盘；用酶联免疫吸附测定法对胎衣不下奶牛和胎衣正常排出奶牛血清和胎盘中的激素含量进行检测，并对检测结果进行分析。结果表明，胎衣不下奶牛血清和胎盘中孕酮、纤维蛋白溶酶原和前列腺素（PGF2α）的含量与胎衣正常排出组相比差异显著降低（P＜0.05），而雌二醇含量则显著升高（P＜0.05）。本试验通过对胎衣不下和胎衣正常排出奶牛血清和胎盘中激素的含量进行检测并比较，结果发现奶牛胎衣不下的发生与血清和胎盘组织中的孕酮、雌二醇、纤维蛋白溶酶原和前列腺素（PGF2α）的含量变化有密切相关的联系，表明奶牛胎衣不下的发生可能与机体内激素分泌紊乱具有很大的关联。

胎衣不下；孕酮；雌二醇；前列腺素（PGF2α）；纤维蛋白溶酶原

奶牛胎衣不下（Retained fetal membranes, RFM）是指奶牛分娩的第三个阶段（胎衣排出期）胎儿排出后12h内未能排出胎衣的产科病症[1]。据文献中报道，美国的奶牛胎衣不下发病率一般在1.3%～39.2%[2,3]；而我国奶牛胎衣不下发病率多在12%～30%之间[4,5]，个别地区甚至高达50%[6～8]。奶牛胎衣不下的继发疾病很多，如不及时治疗，会引发乳房炎、子宫内膜炎、子宫积脓和子宫脱出等产后疾病，影响奶牛泌乳性能、繁殖能力，严重者甚至会造成奶牛死亡[9～11]。据统计，奶牛胎衣不下的平均花费，包括治疗费用、人工费用、间接损失等，大约每头患牛需要285美元[2]，经济损失十分严重。因此，奶牛胎衣不下是奶牛产后亟待解决的疾病之一。虽然近年来对该病的发病原因进行了大量研究，但是致使其发病的关键机制至今尚不清楚，直接影响了临床上对该病的防治效果。因此，全面了解奶牛胎衣不下的发生机理，采取有效的检测方法进行早期诊断和治疗是非常重要的。

胎衣不下的发病原因十分复杂，由于胎衣排出过程发生在分娩的第三个阶段，所以其发生很大程度上取决于奶牛体内的一些激素的作用。以往对胎衣不下的研究主要通过对血液中或者胎盘中的激素进行单一分析，无法客观、全面地揭示奶牛胎衣不下的发病原因[12～15]。酶联免疫吸附测定法具有灵敏、特异、快速、简便、可同时检测多种样品等特点，适用于实验室血清学诊断以及大规模的疫病调查[16]。为此，本试验利用酶联免疫吸附测定法对血清和胎盘中相关激素水平的变化进行研究，寻找胎衣不下奶牛整体的激素变化特点，为奶牛胎衣不下的发病机理以及预防和治疗的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物选择

2016年2～3月，在甘肃省荷斯坦牛繁育示范中心按照年龄、胎次、产后体况评分和分娩日期相近的原则，挑取32头围产期荷斯坦牛为试验动物。

1.2 试验试剂与仪器

孕酮免疫分析试剂盒、雌二醇免疫分析试剂盒、纤维蛋白溶酶原免疫分析试剂盒，均购自台湾Abnova公司；前列腺素（PGF2α），购自美国Cloud-Clone Corp 公司；离心机，德国Eppendorf公司生产；酶标仪，美国Molecular Devices公司生产。

1.3 样品采集及分组

试验牛产犊后立刻颈静脉无菌采血，每头10mL，室温静置待血液完全凝固后，4℃、4 000r/min离心10min分离血清，-20℃保存备用。

产后经兽医诊断，将32头奶牛分为胎衣不下组（17头）和胎衣正常排出组（15头）。诊断标准为产犊后12h内，胎衣未排出或未完全排出，则该奶牛被判为胎衣不下。

胎衣正常排出奶牛产后自颈静脉无菌采血后，采集自然脱离子宫的新鲜干净子叶，用无菌生理盐水冲洗残留血迹后，放入封口袋密封，置于-80℃冰箱中保存备用。对胎衣不下奶牛在确诊后颈静脉再采血一次，后期血液处理方法同上，然后实施手术剥离滞留在子宫内的胎衣，用无菌生理盐水冲洗残留血迹，采集子叶放入封口袋密封，置-80℃冰箱中保存备用。

1.4 奶牛主要临床指标观察

观察奶牛胎衣不下的发生率和子宫内膜炎的发病率，记录胎衣排出的时间、恶露排尽时间、首次发情时间、受孕时间等。

1.5 血清和胎盘组织中激素的检测

检测前将冷冻保存的子叶放入冰冷的生理盐水中，除去血液，滤纸拭干，准确称重，放入5mL的匀浆管中，按重量(g)∶体积(mL)=1∶9的比例加入9倍体积的生理盐水于匀浆管中，冰水浴条件下，用眼科小剪尽快剪碎组织块，在匀浆管中充分研磨成匀浆。将制备好的10%匀浆液置于普通离心机或低温低速离心机中，以3000r/min，离心15min，取组织上清液和冷冻保存的血清，按照试剂盒说明书检测孕酮、雌二醇、前列腺素（PGF2α）和纤维蛋白酶原的含量。

1.6 数据处理

采用SAS9.2统计软件对数据进行分析。采用成组法、t检验法对试验奶牛血液和胎盘中激素含量变化进行处理分析。然后通过SAS9.2 统计软件对各项指标进行差异性检测。

2 结果

2.1 主要临床指标观察结果

胎衣正常排出组的15头奶牛，分娩后的恶露排出时间和颜色均正常，有14头奶牛在产后90d内受孕，受孕率93.3%；胎衣不下组的17头奶牛，有4头在产后90d内受孕，其中有8头发生明显子宫炎症。胎衣不下组的总受孕率为23.5%，与胎衣正常排出组相比，差异极显著。结果见表1。

表1 奶牛产后主要临床指标观察结果

2.2 血清和胎盘组织中孕酮、雌二醇、PGF2α及纤维蛋白溶酶原

由表2可知，胎衣不下组血清和胎盘中的孕酮含量均高于胎衣正常排出组，差异显著（P＜0.05），且随着时间推移含量下降。胎衣不下组血清和胎盘中雌二醇的含量均低于胎衣正常排出组，差异显著（P＜0.05），且随着时间推移含量下降。胎衣不下组血清和胎盘中前列腺素（PGF2α）的含量均低于胎衣正常排出组，差异显著（P＜0.05），且随着时间推移含量下降。胎衣不下组血清和胎盘中的纤维蛋白溶酶原含量均低于胎衣正常排出组，差异显著（P＜0.05），且胎盘组织中的纤维蛋白酶原含量高于血清中的纤维蛋白酶原含量，差异显著（P＜0.05）。

表2 奶牛血清和胎盘中激素含量的变化

3 讨论

妊娠晚期，雌激素能够促使子宫肌细胞收缩蛋白的增加，使子宫兴奋产生收缩；另外，雌激素还可以诱导子宫肌缝隙连接蛋白connexin43的表达，促进前列腺素的合成，增加催产素的受体，从而激活子宫，启动分娩[15]。MA等[17]研究表明，羊的分娩发动是由胎儿下丘脑下部-垂体-肾上腺素引起的，分娩过程中子宫内大量的雌激素迅速上升，而维持子宫静息的孕激素含量下降，从而导致子宫被激活。在其他激素如前列腺素、催产素的作用下，子宫开始收缩，分娩启动。而同样对于牛来说，也是由胎儿启动分娩的[18]。本试验发现，胎衣不下奶牛血清中和胎盘中雌激素的含量均低于胎衣正常排出牛，这表明胎衣不下与奶牛体内雌激素的含量较低密切相关，并且随着奶牛在产后雌激素持续下降，促使了胎衣不下的发生。

孕酮是维持妊娠子宫肌静状态的主要激素，孕酮能够使子宫肌层受到抑制，处于松弛状态，阻止分娩的启动。论士春等[13]研究表明，血浆中高水平的孕酮能够抑制子宫的收缩，还能通过负反馈调节作用使垂体后叶素的分泌减少，从而阻止胎衣的排出。周帮会等[19]研究表明，胎衣不下奶牛胎盘中孕酮含量极显著地高于正常组奶牛。这都与本试验结果相近。本试验结果表明，胎衣不下奶牛血清和胎盘中孕酮含量显著高于正常组，且随着胎衣在子宫内停留，孕酮的含量降低缓慢，从而促进胎衣不下的形成。

前列腺素（PGF2α）常常是通过参与其他自体活性物质、激素和神经递质的调解而起作用，其生理作用主要是影响排卵、刺激子宫平滑肌收缩等[20]。其在奶牛繁殖方面主要应用于同期发情、分娩引产和治疗子宫疾病[21]，并且在小动物临床上应用广泛，主要用于治疗子宫蓄脓、超期妊娠、假妊娠、终止妊娠和能够治疗产后子宫内膜炎等[22～24]。刘智喜[25]研究表明，对胎衣不下奶牛注射外源性的PGF2α能够促进胎衣的排出。本试验结果中，正常组胎盘中和血清中PGF2α含量均显著高于胎衣不下组，并且胎衣不下组奶牛在产犊到产犊后12h内，体内PGF2α呈现下降趋势，这可能说明胎衣不下与奶牛机体内PGF2α的含量有密切相关的联系。

纤维蛋白溶酶原是一种血浆蛋白，主要由肝细胞产生。纤维蛋白溶酶原经过纤维蛋白酶原激活因子激活，转变为有活性的纤维蛋白溶酶。纤维蛋白溶酶可以降解纤维蛋白原，也能够将金属蛋白酶前体转变为有活性的金属蛋白酶[26]。因此检测血中纤维蛋白溶酶原的含量，可以了解体内纤溶活动的强弱。中兽医一般认为母畜胎衣不下多由围产期饲养不当，管理不善，风冷相干，致使血脉受寒，淤血郁结所致[27]。从上可知，胎衣不下是气虚血滞症之一，与奶牛血液流变学指标密切相关；而纤维蛋白原是血液流变学的重要指标之一，不但能够通过形成网状结构影响血浆的流动，还能促进红细胞聚集来影响血液黏度。黄会岭等[28]研究表明，胎衣不下奶牛血浆中纤维蛋白酶原含量明显高于健康组，这与本结果相似，胎衣不下奶牛组织和血清中纤维蛋白溶酶原含量显著高于健康奶牛。因此可以使用一些活血化瘀的中药方剂或者降低纤维蛋白溶酶原含量的药品来预防胎衣不下。

4 小结

本研究分析表明，奶牛胎衣不下的发生与奶牛血清和胎盘中的孕酮、雌激素、前列腺素和纤维蛋白溶酶原的含量密切相关。因此，临床上可以通过一些外源性药物来降低体内孕酮和纤维蛋白溶酶原含量，或者提高雌激素、前列腺素的含量来达到预防胎衣不下的目的。

[1] Fourichon C, Seegers H, Malher X. Effect of disease on reproduction in the dairy cow: a meta-analysis[J]. Theriogenology, 2000, 53(9):1729-1759.

[2] Kelton D F. Recommendations for recording and calculating the incidence of selected clinical diseases of dairy cattle[J]. Journal of Dairy Science, 1998, 81(9):2502-2509.

[3] Cui D, Li J, Wang X, et al. Efficacy of herbal tincture as treatment option for retained placenta in dairy cows[J]. Animal Reproduction Science, 2014, 145(1-2):23-28.

[4] 曹杰,齐长明.奶牛胎衣不下发病规律研究[J].中国动物检疫,2007,24(5):41-42.

[5] 何宝祥,杜玉兰.奶牛胎衣不下病因研究[J].广西农业生物科学,2002,21(2):129-133.

[6] 李英俊,臧丽,韦旭斌.胎衣滞克预防奶牛胎衣不下的试验研究[J].黑龙江畜牧兽医,2006,10:95-97.

[7] 苏波,周学军,李培英.奶牛胎衣不下病因及防治效果[J].中国奶牛,2006,5:29-31.

[8] 吴结革,茆达干.奶牛胎衣不下的原因及其治疗[J].中国奶牛,2002,6:37-38.

[9] Cui D, Wang X, Wang L, et al. The administration of Sheng Hua Tang, immediately after delivery to reduce the incidence of retained placenta in Holstein dairy cows[J]. Theriogenology, 2014,81(5):645-50.

[10] 崔东安, 王胜义, 王磊, 等. 中兽药治疗奶牛胎衣不下的系统评价[J]. 畜牧与兽医, 2016,48(8):98-103.

[11] Gr02hn YT. Epidemiology of reproductive performance in dairy cows[J]. Animal Reproduction Science, 2000, 60-61:605-614.

[12] 刘彦威, 邓泽沛, 周占祥. 胎衣不下奶牛分娩前后血浆PGE_2水平变化[J]. 黄牛杂志, 2001, 27(4):28-29.

[13] 论士春, 陈兆英. 胎衣不下奶牛分娩前后血浆孕酮和17β—雌二醇水平的变化[J]. 中国兽医杂志, 1994,10:12-13.

[14] 刘智喜, 李权武, 武浩,等. 奶牛分娩前后血浆类固醇激素水平变化与胎衣不下的关系[J]. 核农学报, 1994,3:172-176.

[15] Mesiano S. Roles of estrogen and progesterone in human parturition[J]. Frontiers of Hormone Research, 2001, 27(1):86-104.

[16] 盖微微, 郑学星, 薛向红,等. 埃博拉病毒VP40蛋白的原核表达及其抗体间接ELISA检测方法的建立[J]. 中国病原生物学杂志, 2013,9:782-786.

[17] Ma X H, Wu W X, Peter W Nathanielsz. Differential effects of natural and synthetic glucocorticoids on cytochrome 17α-hydroxylase (P-450 17, α ) and cytochrome P-450 sidechain cleavage (P-450 scc ) messenger ribonucleic acid in the sheep placenta[J]. American Journal of Obstetrics & Gynecology, 1999, 180(5):1215-21.

[18] Smith R. Parturition.[J]. New England Journal of Medicine, 2007, 356(3):271-83.

[19] 周帮会, 陈斌, 姜国均,等. 胎衣不下奶牛胎盘中孕酮和雌激素含量变化的研究[J]. 湖北农业科学, 2009, 48(8):1968-1970.

[20] 陈杖榴,主编.兽医药理学[M].第二版.北京:中国农业出版社,2003:155-163.

[21] 高进东. PGF2α及其同系物的作用与应用[A].中国畜牧兽医学会小动物医学分会第六次学术研讨会暨中国畜牧兽医学会兽医外科学分会第十八次学术研讨会[C]. 2011.

[22] 刘永旺, 钱存忠, 庄君英,等. 猫子宫蓄脓的诊断与治疗[J]. 畜牧与兽医, 2006, 38(2):44-45.

[23] Romagnoli S E, Camillo F, Cela M, et al. Clinical use of prostaglandin F2 alpha to induce early abortion in bitches: serum progesterone, treatment outcome and interval to subsequent oestrus.[J]. Journal of Reproduction & Fertility Supplement, 1993, 47(47):425-31.

[24] 关德欣, 高芳. 氯前列烯醇治疗犬超期妊娠和假妊娠[J]. 中国兽医杂志, 2004, 40(3):41-41.

[25] 刘智喜. PGF2α对奶牛产后胎衣排出效果临床试验[J]. 中国奶牛, 1994,3:52-53.

[26] 方亮, 邹汉武. 人纤维蛋白溶酶原和人纤维蛋白溶酶的研制进展[J]. 中国输血杂志, 2015, 28(1):94-97.

[27] 周帮会, 王凤霞. 奶牛胎衣不下发病机理研究进展[J]. 动物医学进展, 2008, 29(6):83-86.

[28] 黄会岭, 张智蕾. 奶牛胎衣不下血液流变学主要指标的变化[J].中国奶牛, 1999,6:16-18.

Serum and Placental Hormone Changes in Retained Placenta Cows

ZHU Yong-gang, WANG-Lei, WANG Xu-rong, ZHANG Jing-yan, CUI Dong-an, ZHANG Kai, ZHANG Kang, WANG Xue-zhi, LI Jian-xi, YANG Zhi-qiang
(Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Science of CAAS/Engineering &Technology Research Center of Traditional Chinese Veterinary Medicine of Gansu Province, Lanzhou 730050)

In order to study the change characteristics of hormone in serum and placenta of retained placenta cows and establish the prevention and treatment of retained placenta, which can elucidate the pathogenesis of the disease. this study aims to analysis the serum and placental hormone of retained placenta cows based on enzyme-linked immunosorbent method. Thirty-two serums were collected after calving, of which seventeen were cows without retained fetal membranes and fifteen were cows with retained fetal membranes. Placenta were collected after serum were collected in cows without retained fetal membranes. The venous blood and the placenta were collected after the cows with retained fetal membranes were diagnosed. The enzyme-linked immune adsorbent were used to test the hormone levels in the serum and placenta of cows with retained fetal membranes and cows without retained fetal membranes, and the testing results were analyzed. The results showed that the content of of progesterone, fibrinogen, and the prostaglandin in the serum and placenta of cows with retained fetal membranes compared with the cows without retained fetal membranes group differences significantly reduced (P＜0.05), but estradiol levels were significantly increased (P＜0.05). The hormone content in serum and placenta of cows with retained fetal membranes and cows without retained fetal membranes were tested in this experiment, which found that the morbidity of retained fetal membranes were associated with the the content changes of progesterone, estradiol ,fibrinogen and prostaglandin in serum and placental tissue, which indicates that retained fetal membranes can happen may associated with hormone secretion disorder within the body.

Retained fetal membranes; Progesterone; Estradiol; Prostaglandin F2α; Plasminogen

S858.23

A

1004-4264（2017）04-0044-04

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.04.012

2016-11-04

公益性行业（农业）科研专项项目（201303040）；国家奶牛产业技术体系（CARS-37-06）。

朱永刚（1991-），男，安徽安庆人，硕士，主要从事奶牛疾病相关的研究工作。

杨志强（1957-），男，四川武胜人，硕士，主要从事奶牛疾病相关的研究工作。