藏红花素对光老化皮肤成纤维细胞的影响

邓明武 张溢晨 李 东 于子优 王祥盛 张文杰

藏红花素对光老化皮肤成纤维细胞的影响

邓明武 张溢晨 李 东 于子优 王祥盛 张文杰

目的探讨藏红花素对光老化皮肤成纤维细胞的影响，期望从细胞水平阐明藏红花素抗皮肤光老化的作用与机理，为临床应用提供依据。方法①分离培养人皮肤成纤维细胞，以不同浓度藏红花素（0、50、100、200 μM）处理皮肤成纤维细胞，培养72 h后，应用CCK－8试剂盒检测细胞增殖情况。②以不同剂量紫外线（25、50、100 mJ/cm2）照射皮肤成纤维细胞，72 h后应用CCK－8试剂盒检测细胞增殖情况。③以不同浓度藏红花素（0、12.5、25、50、100 μM）处理皮肤成纤维细胞24 h，紫外线（100 mJ/cm2）照射后即刻，应用流式细胞仪检测细胞内活性氧簇含量；照射后48 h后，应用流式细胞仪检测细胞周期；照射后72 h后，应用CCK－8试剂盒检测细胞增殖情况，并提取细胞RNA，应用RT-PCR技术检测细胞Ⅰ型胶原的表达。结果①低浓度藏红花素（50、100 μM）对皮肤成纤维细胞增殖无显著影响，高浓度藏红花素（200 μM）可促进皮肤成纤维细胞增殖。②紫外线照射可显著抑制皮肤成纤维细胞增殖，并呈量效依赖关系。③紫外线照射提高细胞活性氧簇产生、抑制细胞增殖、抑制Ⅰ型胶原的表达，藏红花素（12.5、25、50、100 μM）能减少紫外线照射引起的细胞活性氧簇产生，恢复细胞周期和Ⅰ型胶原的合成能力。结论藏红花素通过减少细胞活性氧簇，产生抵抗紫外线照射的作用，恢复皮肤成纤维细胞细胞增殖和胶原合成能力，起到抗光老化作用。

皮肤光老化藏红花素抗氧化

皮肤光老化（Photoaging）是由于皮肤长期受到日光照射所引起的损害，表现为皮肤粗糙、增厚、深而粗的皱纹，局部有过度的色素沉着或毛细血管扩张等，其病理机制主要包括紫外线抑制皮肤成纤维细胞增殖和胶原分泌，促进基质金属蛋白酶合成而导致胶原降解等[1]。改善皮肤光老化的方法有很多，包括药物治疗、外科治疗、注射性治疗等[2]，其中抗衰老化妆品的应用较为普及。

藏红花（番红花，Crocus sativus L.），是一种鸢尾科番红花属的多年生花卉，含胡萝卜素类化合物，主要成分为藏红花素（Crocin）和藏红花酸（Crocitin）[3]。藏红花具有调节免疫、抗肿瘤、抗衰老和美容养颜的功效，其作用机理的亚久主要集中于藏红花素，重点在免疫调节、抗肿瘤等方面，而在抗皮肤衰老方面缺乏相关研究[3-4]。基于光老化过程中的病理变化，研究藏红花素对皮肤成纤维细胞的影响，有望从细胞水平阐明藏红花素抗皮肤光老化的作用与机理，为推广应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

主要试剂包括：藏红花素、Propidium iodide、FITC-Phalloidin（美国Sigma公司），胎牛血清（美国HYCLONE公司），高糖DMEM培养液、胰蛋白酶（美国Gibco公司），维生素C（上海伯奥生物科技公司），Ⅰ型胶原酶、中性蛋白酶（美国Invitrogen公司），Rosiglitazone粉剂（美国Abcam公司），CCK-8试剂盒（美国Beyotime公司），β-半乳糖苷酶染色试剂盒（美国CST公司），ROS检测试剂盒（碧云天生物技术研究所），BCA蛋白浓度测定试剂盒（美国Thermo公司）。

主要仪器包括：UVB灯管TL20W 01-RS（荷兰Philips公司），紫外光能量测试仪（中国台湾Lutron公司），共聚焦荧光显微镜（德国Lecia公司），倒置显微镜及摄像系统（日本Olympus公司），全波长酶标仪（美国Thermo公司），流式细胞检测仪（美国Beckman Coulter公司），荧光定量PCR仪（美国Agilent Technologies公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

正常人皮肤组织来自我院泌尿外科包皮环切术废弃组织，获患者知情同意。将切取的正常皮肤组织用0.25%氯霉素和生理盐水冲洗3遍，去除皮下结缔组织；将皮肤剪成小块，加入0.3%（w/v）的中性蛋白酶，4℃消化过夜；次日分离表皮真皮，将真皮成分剪成糊状，加入0.3%Ⅳ型胶原酶，37℃摇床中消化3 h后，200目筛网过滤，1 500 r/min离心5 min，弃上清，PBS振荡混匀，1 500 r/min离心5 min，以洗去胶原酶，弃上清，加DMEM制成细胞混悬液，接种于含10%血清的DMEM培养基，3 d换液一次，5 d传代一次。实验采用第3、4代成纤维细胞。

1.2.2 藏红花素溶液的配置

藏红花粉剂溶于无菌PBS中，终浓度10 mmol/L，避光保存。使用时以含10%血清的DMEM培养液稀释成12.5、25、50、100、200 μM浓度。

1.2.3 藏红花素对皮肤成纤维细胞增殖的影响

取成纤维细胞以2 000个/孔的细胞密度接种于96孔板，分别加入不同浓度（0、50、100、200 μM）藏红花素，每个浓度设5个复孔，培养72 h后应用CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况，实验重复3次。

1.2.4 细胞光老化模型的建立

取成纤维细胞以2 000个/孔的细胞密度接种于96孔板，培养24 h后弃培养液，加入10 μL PBS，将96孔板置于UVB灯管正下方6 cm，能量测试仪测紫外光强度，计算照射时间，使照射总剂量分别达到25、50、100 mJ/cm2，将不接受紫外线照射的细胞设为对照组，每组设5个复孔，照射后吸去PBS，重新加入含10%血清的DMEM培养液，继续培养72 h后，应用CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况，实验重复3次。

1.2.5 藏红花素抗皮肤成纤维细胞光老化作用

取成纤维细胞以2 000个/孔的细胞密度接种于96孔板，以及1×105个/孔的密度接种于6孔板，分别加入不同浓度（0、12.5、25、50、100 μM）藏红花素和150 μM维生素C，培养24 h后弃培养液，96孔板中加10 μL PBS，6孔板中加入400 μL PBS，将96孔板、6孔板置于UVB灯管正下方6 cm，照射总剂量为100 mJ/cm2。将不接受紫外线照射的细胞设为空白对照组，不加入藏红花素的细胞设为阴性对照组（UVB组），加入维生素C的细胞设为阳性对照组（Vit C组），照射后分别检测：①照射后即刻，应用ROS试剂盒染色，共聚焦显微镜观察；胰酶消化细胞后，应用流式细胞仪检测荧光强度。②照射后24 h，胰酶消化收集细胞，Propidium iodide染色，应用流式细胞仪分析细胞周期；③照射后继续培养72 h，应用CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况；④照射后72 h，收集细胞提取总RNA，应用RT-PCR检测Ⅰ型胶原基因表达。上述实验均重复3次。

1.2.6 统计学分析

所有数据采用SPSS.19统计软件进行0ne-Way ANOVA-Dunnett统计分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 藏红花素对皮肤成纤维细胞增殖的影响

为了明确单纯藏红花素对细胞是否有毒副作用，首先对培养至第3或4代的皮肤成纤维细胞予以不同浓度藏红花素（0、50、100、200 μM）处理。孵育72 h后，CCK－8试剂盒检测细胞增殖情况。结果显示，低浓度（50、100 μM）藏红花素对成纤维细胞增殖无显著影响，而高浓度（200 μM）藏红花素可显著促进成纤维细胞增殖（图1），提示藏红花素对成纤维细胞无毒副作用。

图1 不同浓度藏红花素对皮肤成纤维细胞增殖的影响Fig.1 Effects of different concentrations of crocin on the proliferation of skin fibroblasts

2.2 细胞光老化模型的建立

为了探索合适的照射剂量，给予第3代皮肤成纤维细胞不同剂量的UVB照射（25、50、100 mJ/cm2），72 h后应用CCK-8试剂盒检测细胞增殖。结果显示，UVB照射能抑制成纤维细胞增殖，抑制作用与照射剂量呈量效依赖关系（图2），根据抑制作用程度，选择100 mJ/cm2作为光老化模型的照射剂量。

图2 不同紫外线照射剂量对皮肤成纤维细胞增殖的影响Fig.2 Effects of different doses of ultraviolet light on the proliferation of skin fibroblasts

2.3 藏红花素抗皮肤成纤维细胞光老化的作用

不同浓度藏红花素（0、12.5、25、50、100 μM）预处理皮肤成纤维细胞24 h，UVB（100 mJ/cm2）照射后即刻检测细胞内ROS，与不照光的对照组相比，UVB照射显著增加细胞内ROS含量，而抗氧化剂维生素C可抑制ROS的产生，藏红花素同样也能抑制ROS的产生（表1）。

表1 藏红花素对紫外线照射后成纤维细胞胞内ROS的影响Table1 Effects of crocin on the intracellular ROS of skin fibroblasts after ultraviolet irradiation

细胞周期分析显示，紫外线照射后G0/G1期细胞数量减少，G2/M期细胞显著增加，而维生素C和藏红花素处理都能恢复细胞周期，使之与正常细胞周期接近（表2）。

表2 藏红花素对紫外线照射后成纤维细胞细胞周期的影响Table2 Effects of crocin on cell cycle of skin fibroblasts after ultraviolet irradiation

细胞增殖检测显示，紫外线照射后出现细胞增殖抑制，而维生素C和藏红花素都能抵抗紫外线的抑制作用，恢复细胞增殖（图3）。

图3 不同浓度藏红花素对紫外线照射后皮肤成纤维细胞增殖影响Fig.3 Effects of different concentrations of crocin on the proliferation of skin fibroblasts after ultraviolet irradiation

RT-PCR分析显示，细胞Ⅰ型胶原的表达在紫外线照射后显著降低，而维生素C和藏红花素处理均能恢复细胞Ⅰ型胶原的表达（图4）。

图4 藏红花素对紫外线照射后成纤维细胞I胶原表达影响Fig.4 Effects of different concentrations of crocin on the expression of type I collagen of skin fibroblasts after ultraviolet irradiation

3 讨论

皮肤光老化常见于长期户外工作的人群，其外观表现与自然老化的皮肤明显不同。自然老化通常表现为皮肤变薄、松弛，而光老化皮肤表现为皮肤粗糙、增厚、深而粗的皱纹，局部有过度的色素沉着或毛细血管扩张等[5]。文献报道一名从事货运25年的卡车司机，其左半侧脸因受长期光照，呈现出光老化的皮肤改变，而右半侧表现为皮肤自然老化的特征，显示了光老化的累积效应[6]。皮肤光老化的病理机制研究认为，紫外线对皮肤上皮细胞和成纤维细胞产生损伤，抑制细胞增殖和胶原的分泌，诱导基质金属蛋白酶合成的增加，进而促进胶原的降解。紫外线照射可使细胞内的ROS增加，影响细胞活力和功能，还可引起DNA突变，导致细胞凋亡或细胞周期阻滞[7]。

皮肤光老化的预防主要在于减少紫外线辐射，和涂抹防嗮霜等，对于已经受紫外辐射的皮肤，可以采用保护性的面膜修复等方法。从损伤机制分析，具有抗ROS产生的化合物，理论上可以起到修复的作用，除了常见的还原剂（如维生素C）以外，一些植物及中药提取物也被广泛应用，例如芦荟、藏红花等[8]。藏红花是传统中药材，具有调节免疫、抗肿瘤、抗衰老和美容养颜的功效。研究表明，藏红花素具有抗氧化作用，能保护氧化应激引起的心肌细胞、肾上皮细胞和角膜上皮细胞损伤等[9-11]。因此，我们推测其可以对抗光老化过程中，细胞内异常增高的ROS，进而修复损伤的细胞。

本研究首先分析了藏红花素对皮肤成纤维细胞的毒副作用，我们检测了50、100、200 μM藏红花素对成纤维细胞增殖的影响，结果显示，低浓度（50、100 μM）藏红花素对成纤维细胞增殖无显著影响，而高浓度（200 μM）藏红花素能促进成纤维细胞增殖，提示藏红花素对成纤维细胞无毒副作用，这与文献报道的相关结果一致[12]。

紫外灯照射是常用的光老化模型，不同剂量的照射可以产生不同的生物学效应，以往研究采用的照射剂量有一定的差别，低剂量照射可以产生细胞老化作用，而大剂量的紫外线照射可以直接引起细胞的坏死和凋亡[13]。为了建立光老化模型，我们探讨了不同的紫外线照射剂量对细胞的影响，合适的照射剂量可引起细胞的损伤，但不会导致细胞的坏死和凋亡，以达到造成细胞老化的目的。本实验中，皮肤成纤维细胞在受到不同剂量紫外线照射后，细胞增殖均有抑制，并呈量效依赖关系，该剂量范围内没有发现细胞坏死和凋亡。因此，实验选择100 mJ/cm2为光老化模型照射剂量。

为了证实藏红花素抗皮肤成纤维细胞光老化的作用，我们对药物及紫外光照处理的细胞进行了多个指标的分析。本实验中，皮肤成纤维细胞在受到紫外线照射后，出现胞内ROS水平升高，细胞周期在G2/M期阻滞，细胞增殖下降，Ⅰ型胶原合成减少，但没有发现细胞坏死和凋亡，符合细胞光老化的特征。阳性对照组维生素C处理，可降低胞内ROS水平，恢复细胞的增殖能力，与文献报道一致[14-15]。本研究发现，藏红花素处理同样具有降低胞内ROS的作用，并能对抗紫外线照射引起的细胞周期阻滞，恢复细胞的增殖能力，这可能与藏红花素降低胞内ROS水平，使得DNA损伤减少有关。提示藏红花素具有抗皮肤成纤维细胞光老化的作用。研究中，我们采用了不同的药物剂量，但没有看到明显的量效依赖关系，说明在现有的损伤程度下，低剂量藏红花素可能已产生饱和的作用。反复多次照射，加大细胞损伤后，藏红花素是否会显示更显著的保护作用，则需要进一步探讨。

以往研究表明，紫外照射引起细胞内ROS增多，可导致一系列信号通路的激活或抑制[16]。比如抑制TGF-β通路，抑制细胞外基质胶原的合成；激活MAPK通路，导致基质金属蛋白酶生成增多，促使胶原蛋白等降解增多。我们推测，藏红花素也是通过降低胞内ROS水平，进而激活或抑制相关信号传导通路，使胶原合成增加，基质金属蛋白酶生成减少，相关信号通路分子的变化正在进一步研究中。

综上所述，本研究证实，藏红花素可通过减少细胞ROS，产生抵抗紫外线照射作用，恢复皮肤成纤维细胞增殖和胶原合成能力，起到抗光老化作用。

本论文第二作者为高中学生，利用假期及课余时间，全程参与了本课题的细胞培养、药物处理，以及结果收集和数据的统计分析，为培养和鼓励青少年对基础医学研究的兴趣和热情，并结合其在本课题中的贡献程度，将其列为第二作者。特此说明。

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Effects of Crocin on Photoaged Skin FibroblastsDENG Mingwu1,ZHANF Yicheng2,LI Dong1,YU Ziyou1,WANF

Xiangsheng1,ZHANG Wenjie1.1 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.2 ShanghaiStarrierBilingualSchool,Shanghai201108,China.Correspondingauthor:ZHANGWenjie(E-mail: wenjieboshi@aliyun.com).

ObjectiveTo investigate the protective effects of crocin on photoaged skin fibroblasts,and elucidate the mechanism of crocin on anti-photoaging,which could provide new evidence for clinical application of crocin.Methods1. Human skin fibroblasts were isolated and treated with different concentration of crocin(0,50,100,100 μM)for 72 hours.CCK－8 assay was performed to detect cell proliferation.2.Fibroblasts were irradiated with different doses of ultraviolet light(25,50, 100 mJ/cm2),cell proliferation was measured by CCK－8 kit after 72 hours.3.Fibroblasts were treated with different concentration of crocin(0,50,100,100 μM)for 24 hours and irradiated by ultraviolet light(100 mJ/cm2).Intracellular reactive oxygen species(ROS)were analyzed immediately by flow cytometry.Cell cycles were analyzed 48 hours after irradiation by flow cytometry.Seventy-two hours after treatment,cell proliferation was measured by CCK－8 kit,total RNA was extracted,and the expression of typeⅠcollagen were detected by RT-PCR.Results1.Low concentration of crocin(50,100 μM)had no significant effect on the proliferation of skin fibroblasts while high concentration of crocin(200 μM)promoted cell proliferation. 2.Ultraviolet irradiation inhibited the proliferation of skin fibroblast in a dose dependent manner.3.Ultraviolet irradiation enhanced cellular level of ROS,and inhibited cell proliferation and the expression of typeⅠcollagen.Crocin(12.5,25,50,100 μM)treatment reduced the production of ROS caused by ultraviolet irradiation,and restored the cell cycle,cell proliferation,and type I collagen expression.ConclusionCrocin prevent the photoaging of dermal fibroblasts against ultraviolet irradiation by reducing the cellular level of ROS and restoring the cell cycle and type I collagen expression.

Skin photoaging;Crocin;Antioxidation

R758.14

A

1673－0364（2017）02－0077－05

2017年1月12日；

2017年3月9日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.02.005

200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科；上海市组织工程重点实验室（邓明武，李东，于子优，王祥盛，张文杰）；201108上海市上海星河湾双语学校（张溢晨）。

张文杰（E-mail：wenjieboshi@aliyun.com）。