不同培养条件对烟草青枯病菌生长的影响

胡蓉花，程淑君，王建峰，罗建军，刘琼光

（1.江西省吉安市烟草公司，江西 吉安 343009；2. 华南农业大学农学院，广东 广州 510642）

不同培养条件对烟草青枯病菌生长的影响

胡蓉花1，程淑君2，王建峰1，罗建军2，刘琼光2

（1.江西省吉安市烟草公司，江西 吉安 343009；2. 华南农业大学农学院，广东 广州 510642）

比较了9种阳离子、碳源、氮源和pH值对烟草青枯菌生长的影响，结果表明，不同阳离子对烟草青枯菌生长的影响具有差异，在1 mmol/L浓度条件下，Ca2+、K+、Mg2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+等离子间对青枯菌生长影响差异较小，而与Cu2+、Al3+差异较大；在10 mmol/L浓度条件下，Mn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Al3+等离子显著抑制青枯菌生长；在30 mmol/L浓度条件下，Ca2+、K+明显抑制青枯菌生长，而Mg2+在60 mmol/L浓度下，仍青枯菌生长良好。此外，研究结果还表明，青枯菌生长最适宜的pH值为7，最适宜的碳源为蔗糖，最适宜的氮源为蛋白胨，硝态氮氮源不利于青枯菌生长。

烟草青枯病菌；阳离子；碳氮源；pH值

由茄科劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum，俗称青枯菌）引起的烟草青枯病，是烟草的毁灭性病害之一，也是典型的土传病害。作物青枯病在我国华东、西南和华南地区发生尤为严重，目前尚未有理想的防治药剂和有效措施［1-2］。植物抵抗病害的能力与其营养水平密切相关，平衡施肥技术从植物保护的角度来讲，既要保证作物的最佳生长，又要兼顾使作物获得最大抗性［3］。矿质元素是植物正常生长发育所必需的，包括大量元素和微量元素，其中有些矿质元素对真菌、细菌、病毒等病原物引起的侵染性病害有显著影响［4］。矿质营养以多种不同的方式影响土传病害的发生和病原菌的生长［5］。无论是在室内还是在田间条件下，矿质营养对各种植物病害的发生发展均有一定影响［6］，但其作用机理尚不十分清楚。。

目前，关于营养与青枯病关系方面的研究主要集中在有机肥或有机土壤改良剂［7-8］，单从某种或几种矿质元素与青枯病发生关系的研究相对较少，尽管也有少量文献报道某些元素对青枯菌生长的影响［9］，但是研究还不完善和深入。况且，来自不同地域的青枯菌，对一些营养元素的利用能力和敏感水平可能存在差异。本研究分析了不同的碳源、氮源及9种阳离子对烟草青枯病菌生长的影响，以期为青枯病防治的新型植物保护剂的研发和生产上青枯病的有效防控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株：烟草青枯病菌菌株Tb590，由华南农业大学细菌研究室保存提供。测定时，先将菌株活化，取单菌落接种到LB培养液中，30℃摇床培养24 h，用于各项测定实验。

LB培养液：胰蛋白胨 10 g/L、酵母提取物 5 g/L、氯化钠 5 g/L，pH7.0。

不同阳离子培养基配制：在LB培养液的基础上分别加入CaCl2、KCl、MgSO4、ZnSO4、CuSO4、FeSO4、AlCl3、FeCl3、MnSO4等试剂，每种阳离子各自配制成终浓度为1、10、30、60、90 mmol/L的LB培养液，用HCl或NaOH调整pH值为7，试管分装，每管5 mL，消毒灭菌。所有试剂均为国产分析纯。

碳源利用基础培养基：酵母膏 10 g/L、NaH2PO40.5 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl20.1 g/L。

氮源利用基础培养基：葡萄糖10 g/L、Na2HPO42.13 g/L、KH2PO41.36 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl20.005 g/L、FeSO4·7H2O 0.5 mg/L。

1.2 不同阳离子对青枯菌生长的影响测定方法

取培养24 h的新鲜Tb590菌液50 μL，分别接种到阳离子培养液中，每种阳离子每个浓度3个重复，30℃摇床培养24h。以接种和不接种培养0 h的LB培养基为对照，用分光亮度计测定λ = 600 nm的光吸收值（OD600）。

1.3 不同pH对烟草青枯病菌生长的影响

在LB培养基中，用HCl或NaOH调节其pH值分别为3、4、5、6、7、8、9、10。接种青枯菌和测定方法同1.2。

1.4 不同碳、氮源对烟草青枯病菌生长的影响

以1%的量分别将葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、甘露醇、甘油加入碳源基础培养基，制成不同碳源培养基；以1%的量分别加入NaNO3、NH4H2PO4、（NH4）2SO4、NH4Cl、牛肉膏、酵母膏、蛋白胨等制成不同氮源培养基。接种青枯菌和测定方法同1.2。

2 结果与分析

2.1 不同阳离子对烟草青枯病菌生长的影响

不同浓度Ca2+对烟草青枯菌生长的影响具有明显差异。Ca2+浓度为1 mmol/L和10 mmol/L时，青枯菌生长较好，OD600均为1.0左右。当Ca2+浓度≥30 mmol/L时，青枯菌生长受到明显抑制，OD600降为0.0805，且Ca2+浓度为90 mmol/L时，完全抑制了青枯菌的生长（表1）。

从表1可以看出，K+浓度为10 mmol/L和1 mmol/L时，青枯菌生长较好，当K+浓度≥30 mmol/L时，青枯菌生长受到明显抑制。当Mg2+浓度≤60 mmol/L时，青枯菌生长较好，且它们之间的OD600值差异不明显；只有当Mg2+浓度≥90 mmol/L时，青枯菌的生长才受到明显的抑制。

表1 不同离子浓度对烟草青枯病菌生长的影响

不同浓度的Mn2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+和Fe3+对烟草青枯菌生长的测定结果（表1）表明，当浓度为1 mmol/L时，青枯菌生长较好，而当其浓度≥10 mmol/L时，青枯菌的生长则受到明显抑制。但Fe2+浓度为60 mmol/L和90 mmol/L，其OD值稍高于30 mmol/L时，可能是实验误差导致，有待进一步研究。

不同浓度Al3+对烟草青枯菌生长的测定结果（表1）表明，Al3+浓度为10 mmol/L时，其生长明显比在1 mmol/L和30 mmol/L浓度下要好，当Al3+浓度≥60 mmol/L时，青枯菌生长受到明显抑制。

此外，从表1还可以看出，浓度为1 mmol/L时不同阳离子对烟草青枯菌生长的影响具有明显差异，且在此浓度下，Mg2+、 Fe3+、Fe2+对青枯菌生长较好。Ca2+、K+、Mn2+和Zn2+对青枯菌生长受到一定影响，且与Mg2+、 Fe3+、Fe2+差异显著。Cu2+和 Al3+对青枯菌生长受到明显抑制，与其他各离子均有显著差异。

当阳离子浓度为10 mmol/L时，Mg2+对青枯菌生长最好，其次是Ca2+和K+，Cu2+、Mn2+、Al3+、 Fe3+、Fe2+和Zn2+对青枯菌生长受到明显抑制，与Ca2+、K+差异显著。当阳离子浓度为30 mmol/L时，除了Mg2+对青枯菌生长影响较小外，其他离子均明显抑制青枯菌生长，且与10 mmol/L浓度的生长差异显著。

综合分析以上结果，表明烟草青枯菌能在1 mmol/L和10 mmol/L 的Ca2+、K+、Mg2+离子条件下较好地生长，其中Mg2+对青枯菌生长影响较小；9种阳离子在较高浓度（90 mmol/L）下对烟草青枯菌生长均具有抑制作用，其中Ca2+和Cu2+抑菌作用最明显。在同一浓度10 mmol/L下，Mg2+对青枯菌的生长最好，其次是Ca2+和K+离子，Cu2+、Zn2+和Fe2+离子对青枯菌抑菌作用较明显。研究结果还表明，1mmol/L浓度的不同阳离子对青枯菌生长影响较小，青枯菌生长较好，但1 mmol/L的Cu2+和Al3+离子对青枯菌生长有抑制作用。

2.2 不同pH对烟草青枯病菌生长的影响

烟草青枯病菌在pH3～9条件下均能生长，pH6～8生长较好，其中pH7生长最好，为最适宜pH，pH6较pH8生长好（表2）。

2.3 不同碳、氮源对烟草青枯病菌生长的影响

测定结果发现，烟草青枯菌在不同碳源培养条件下生长差异不显著，但在以蔗糖和甘露醇为唯一碳源的条件下生长较好（表2）。

测定结果发现，烟草青枯菌在不同的氮源条件下生长存在差异，在NaNO3条件下生长受到抑制，而在蛋白胨和牛肉膏条件下生长较好，其中蛋白胨中生长最好。NaNO3和NH4Cl等无机氮对其生长不利（表2）。

3 结论与讨论

以往研究表明，钙营养对番茄青枯病具有较好的控病效果，增加营养液中钙浓度可减轻青枯病严重度［10］。低、中、高钙浓度处理番茄，青枯病的严重度分别为100%、77.1%和56.8%，表明钙能降低青枯病的发生［11］。本试验结果表明，Ca2+浓度≥30 mmol/L时，青枯菌生长受到明显抑制，与浓度为10 mmol/L的差异显著。且Ca2+浓度为90 mmol/L时，完全抑制了青枯菌的生长。由此推测，高浓度钙能降低青枯病的发生可能与其具有抑制青枯菌生长有关，但需要进一步验证。

表2 不同pH值、碳源和氮源对青枯菌生长的影响

郑世燕等［12］室内试验表明，在保证烟株正常生长营养的基础上增施Ca、B、Mg、Mo 等4种矿质元素对烟草青枯病均有一定的控病效果。吴卫玲［13］研究表明，硼酸钠对青枯雷尔氏菌的抑菌效果与其浓度呈正相关，当硼酸钠浓度≥0.5 mmol/L时，对烟草青枯病菌的生长有显著影响，本研究也发现这一现象（结果未显示）。

谭军等［9］研究指出，在添加有微量元素的培养基中，锌和铜对青枯菌的生长影响较大，当钙浓度为 2 mmol/L 时，青枯菌的生长明显受到抑制。本研究的9种阳离子对青枯菌生长测定结果表明，在1 mmol/L浓度条件下，Ca2+、Zn2+、Cu2+、Al3+等离子对烟草青枯菌生长的抑制作用最明显，基本上支持谭军等［9］的研究结果。然而，谭军等［9］设定的离子浓度范围较小，最高浓度只有2 mmol/L，不能真实反映影响青枯菌停止生长的最大浓度，而本研究测定的离子浓度范围较大，能较好反映随着离子浓度升高，明显抑制青枯菌生长的真实情况。如Mg2+只有在较高浓度（90 mmol/L）时，青枯菌生长才明显受到抑制，而在1～60 mmol/L范围内，Mg2+对青枯菌生长并无明显抑制作用。综合本研究结果表明，不同阳离子影响青枯菌生长的浓度范围不完全一致，这为生产上植物的平衡施肥提供了有价值的参考。

本研究在测定不同阳离子对烟草青枯菌生长的抑制作用时，所使用的化学试剂分别为CaCl2、KCl、MgSO4、ZnSO4、CuSO4、FeSO4、AlCl3、FeCl3和MnSO4等，其中的阴离子均为Cl-和SO42-。谭军等［9］通过在培养基中加入Na2SO4并设置培养基终浓度为0.5～5 g/L等6个浓度梯度时，发现不同浓度SO42-对青枯菌生长的影响不明显。而关于氯离子对青枯菌的影响也较少［14］，因此，我们认为，本研究不同阳离子对烟草青枯菌生长的测定结果真实可靠，Cl-和SO42-对烟草青枯菌生长的影响不大，对本研究结果不会产生较大影响。

营养物质是微生物新陈代谢和一切生命活动的物质基础，失去这个基础，生命将停止。本研究结果表明，烟草青枯菌最适生长的pH为7，相对来说，青枯菌在碱性条件下比在酸性条件下生长更差，抑制作用更明显，这与生产上通过增施石灰、提高土壤碱性［15］抑制青枯菌数量，达到减轻青枯病目的相符合。此外，研究结果还发现，烟草青枯菌在蛋白胨和牛肉膏等有机氮中生长较好，而在以NH4Cl和NaNO3为氮源的无机氮中生长明显受抑制，因此，在生产实践过程中，可通过施用硝态氮，控制烟草青枯病的发生。

本研究结果为烟叶生产上的青枯病防治提供了理论依据和指导，生产上可通过营养调控措施，较大限度地抑制病原菌的生长，从而达到控制作物青枯病的目的。

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（责任编辑 杨贤智）

Influence of different culture conditions on Ralstonia solanacearum growth

HU Rong-hua1，CHENG Shu-jun2，WANG Jian-feng1，LUO Jian-jun2，LIU Qiong-guang2
（1.Ji’an Municipal Tobacco Company，Ji’an 343009，China；2. College of Agriculture， South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

Tobacco bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum is a widespread and serious disease in China and is difficult to control. Nutrition is the material basis of microbial metabolism and all life activities. Analyzing the effects of nutrition elements on the growth of R. solanacearum is important for inhibiting the growth of pathogenic bacteria through nutrition regulation measures so as to the bacterial wilt disease control. The growth of R. solanacearum under nine kinds of cations，carbon source，nitrogen source and pH were compared in this study. The results showed that R. solanacearum growth under different cations was different. Under the concentration of 1 mmol/L，little influence of Ca2+，K+，Mg2+，Mn2+，Fe2+，Fe3+were observed on R. solanacearum growth，and their effects were different from Cu2+and Al3+. Under the conditions of 10 mmol/L of Mn2+，Fe2+，Fe3+，Cu2+and Al3+respectively，the R. solanacearum growth was inhibited significantly. When the concentration of Ca2+and K+was 30 mmol/L，the R. solanacearum growth was inhibited，while the concentration of Mg2+was 60 mmol/L，R. solanacearum grew well. In addition，the results also showed that pH value 7，sucrose and peptone were the best for R. solanacearum growth. Nitrate nitrogen source was against R. solanacearum growth.

Ralstonia solanacearum；cation；carbon and nitrogen sources；pH

S432.4+2

A

1004-874X（2017）02-0124-05

2016-09-15

中国烟草总公司江西省公司科技项目（赣烟司［2015］7 号，赣烟司［2016］81 号）；江西省吉安市烟草专卖局（公司）科技项目（吉烟科［2014］3 号）；国家公益性行业（农业）科研专项（201303015-07）

胡蓉花（1970-），女，高级农艺师，E-mail：1908479316@qq.com

刘琼光（1964-），男，博士，副教授，E-mail：qgliu@scau.edu.

胡蓉花，程淑君，王建峰，等. 不同培养条件对烟草青枯病菌生长的影响［J］.广东农业科学，2017，44（2）：124-128.