堆肥中木质素降解细菌MZ-9的筛选及产酶条件优化

邓奥宇，关统伟，王鹏昊，李智强，向慧平，赵顺先，张习超

（1.西华大学微生物研究所/食品生物技术四川省高校重点实验室，四川 成都 610039；2.成都华宏生物科技有限公司，四川 成都 611833）

堆肥中木质素降解细菌MZ-9的筛选及产酶条件优化

邓奥宇1，关统伟1，王鹏昊1，李智强2，向慧平1，赵顺先1，张习超1

（1.西华大学微生物研究所/食品生物技术四川省高校重点实验室，四川 成都 610039；2.成都华宏生物科技有限公司，四川 成都 611833）

在堆肥中依次采用铁氰化钾显色、愈创木酚显色、苯胺蓝（Azure-B）退色圈试验以及液体发酵验证试验测得漆酶（Lac）、锰过氧化物酶（MnP）的活性分别高达9.53 U/mL、21.56 U/mL，木质素降解率达20.32%，从而筛选到一株高活性木质素降解菌株MZ-9。生理生化试验及16S rDNA序列分析表明，菌株MZ-9属于芽孢杆菌属（Bacillus），与地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）相似性为99.2%。产酶条件试验表明，当pH值8.0、培养温度37℃、接种量8%、培养时间6 d时，菌株MZ-9的Lac、MnP活性最高，此时木质素降解率为20.51%。因此，菌株MZ-9是一株优良的木质素降解菌株，在木质素降解方面具有很好的开发利用价值，可为后续的工业化生产提供可靠的菌种资源支撑。

堆肥；地衣芽孢杆菌；漆酶（Lac）活性；锰过氧化物酶（MnP）活性；木质素；生物降解

随着社会经济和人口增长，农业种植以及种植过程中产生的农业固体废物也在不断增长；农业固体废物的堆肥化周期长的主要原因是堆体中大多是作物秸秆，其中木质素又是作物秸秆的主要组分。木质素是一种存在于大部分陆地植物中、主要由3种苯基丙烷类单体通过无规则交联聚合形成的多酚类聚合物［1］，大约占陆地植物生物量的1/3，该聚合物以共价键和非共价键相互结合，具有完整坚硬的外壳，很难被微生物降解，成为限制堆肥腐熟的关键因素。然而，我国每年各类农作物秸秆产量高达20亿～30亿t，约占全世界总产量的20%～30%［2］。秸秆是一种宝贵的可再生资源，是我国发展农业循环经济的重要物质基础［3］，但由于其结构致密、难以被微生物降解，使得我国农村秸秆资源长期处于高消耗、高污染、低产出的状况［4］。相当一部分农作物秸秆被弃置或焚烧，没有得到合理开发利用，造成了资源浪费和环境污染，可见，筛选高效降解木质素的菌种是目前生物质降解的重要研究方向之一［5］。

近年来，国内外关于木质素降解菌的报道很多，但大部分研究集中在真菌对木质素的降解上，在有效利用细菌加快木质素腐熟方面的报道很少［6］。除真菌外，细菌也是木质素生物降解过程中一个重要参与者［7］，如印度的一个研究团队从造纸废水中分离出10余株具有木质纤维素降解能力的细菌，在应用于造纸黑液处理时都展现出了良好效果。研究者们还从造纸废水或森林土壤中筛选鉴定出不同种属的细菌，如Klebsiella sp. BRL6-2、Sphingomonas paucimobilis SYK-6、Bacillus sp.等，初步证实它们具有打开木质素联苯结构的功能［8-10］。然而，21世纪以前，大多数研究表明细菌降解木质素的能力比真菌差，可是由于细菌来源广泛、生长快速、易于大规模应用，被认为在木质素的生物降解过程中充当着辅助真菌降解的重要作用［11］，并且木质素的降解是个复杂的环境，需要生物具有较强的适应性及多样化的功能，才能在复杂环境中发挥协同作用［12］，因此高效木质素降解细菌的挖掘具有重要研究意义。本研究希望从堆肥中筛选出高活性木质素降解细菌，与真菌配合降解秸秆，提高秸秆资源的利用率，开发商业化的生物技术应用，并对其相关酶学和生物学特性展开研究，为开发具有实际应用价值的木质纤维素生物降解技术奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验样品为成都华宏生物科技有限公司生产基地中的堆肥。

主要仪器设备及试剂：电热恒温培养箱（黄石恒丰医疗器械有限公司生产）、恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司生产）、电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司生产）、数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂生产）、电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司生产）、涡旋振荡仪（北京金紫光科技发展有限公司生产）、立式压力蒸汽灭菌器（上海中安医疗器械厂生产）、双定时电泳仪（北京市六一仪器厂生产）、低温离心机（上海安亭科学仪器厂生产）。琼脂、蛋白胨、酵母粉、葡萄糖，由北京奥博星生物技术有限责任公司生产；苯胺蓝、铁氰化钾、愈创木酚、乙酸钠、乙酸、乳酸钠、硫酸锰、硫酸亚铁铵、重铬酸钾、氯化钡、（NH4）2SO4、NaCl、KH2PO4由成都科龙化工试剂厂生产。

主要培养基：（1）LA培养基：琼脂20 g、蛋白胨10 g、酵母膏5 g、NaCl 10 g、蒸馏水1 000 mL，pH 7.0；（2）筛选培养基：琼脂20 g、蛋白胨10 g、酵母膏5 g、NaCl 10 g、蒸馏水1 000 mL，每100 mL含铁氰化钾0.15 g，pH 7.0；（3）LA-愈创木酚培养基：LA培养基中加入0.04%的愈创木酚；（4）LA-苯胺蓝培养基：LA培养基中加入0.1 g/L苯胺蓝。

1.2 试验方法

1.2.1 降解木质素菌株筛选试验 （1）菌株初筛：取5 g样品放入装有100 mL无菌水的三角瓶中浸泡低速震荡12 h，然后取样品水样梯度稀释10-3涂布于筛选培养基上，恒温37℃培养3～4 d，产生蓝色变色圈的为阳性菌落。（2）LA-愈创木酚平板显色：采用愈创木酚平板显色法，用无菌接种环将分离纯化的菌种点种于LA-愈创木酚固体培养基平板上，37℃恒温培养5～7 d，产生棕红色变色圈的为阳性菌落，即可得产漆酶（Laccase，Lac）的菌株［13］。（3）LA-苯胺蓝培养基平板退色：采用苯胺蓝平板水解透明圈法，用无菌接种环将分离纯化的菌种点接于LA-苯胺蓝固体培养基平板上，37℃恒温培养5～7 d，产生透明圈的为阳性菌落，即可得产锰过氧化物酶（Manganese Peroxidase，MnP）的菌株［14］。

1.2.2 液体发酵产酶试验 将1.2.1中筛选出的菌株进行液体发酵产酶试验，将活化的菌液接种于300 mL LA液体培养基中，接种量5%，37℃下150 r/min振荡培养；3 d后向装有300 mL菌液的锥形瓶中加入粉碎的玉米秸秆10 g，振荡3 d后开始取样检测。每隔2 d取样1次，分别测定发酵液中Lac和MnP的活性以及木质素含量。粗酶液制备方法如下：取1.5 mL菌液，于低温离心机4℃下6 000 r/min离心10 min，取上清液，即为粗酶液。其中，Lac、MnP的活性测定参照文献［15-16］，木质素含量的测定和计算参照文献［17］。

1.2.3 菌株鉴定试验 （1）参照《伯杰细菌鉴定手册》［18］和《常见细菌系统鉴定手册》［19］对细菌进行耐盐性、pH生长范围、温度生长范围、产酸、酶学以及其他生理生化试验。（2）选择细菌通用引物，Eμ27F：（Forwardprimer， 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1490R （Reverse primer，5’-GGTTACCTTFTTACFAC GACTT-3’）。PCR反应条件为：95℃、4 min；95℃、60 s；56℃、60 s；72℃、120 s，35个循环；72℃、10 min。PCR产物纯化按照OMEGA公司E.Z.N.Z.TM Gel Extrac-tion Kit试剂盒说明的步骤进行。纯化后送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序，然后用BLAST程序将所测序列与NCBI GenBank数据库进行同源性分析。选择相应参比菌株序列，采用MEGA 6.0软件构建系统发育树。

1.2.4 菌株产酶条件研究试验 经过前期试验并结合文献［11］发现，木质素酶活性的主要影响因素为pH值、培养温度、接种量、培养时间，因此，本试验采用液体发酵产酶试验，研究以上4个因素对产酶的影响，探索最佳产酶条件。pH值设5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，培养温度设27、32、37、42、47、52℃，接种量设2%、4%、6%、8%、10%，培养时间设2、4、6、8、10、12、14 d。单因素试验后，分别以MnP、Lac的活性为考核指标，按L9（34）正交因素水平表（表1）进行试验，选出最优组合，将活化的菌液接种于300 mL LA液体培养基中，按照最佳组合的培养条件振荡培养，3 d后向装有300 mL菌液的锥形瓶中加入粉碎的玉米秸秆10 g，14 d后结束振荡并测定木质素降解率。

表1 影响木质素酶活性因素水平表

2 结果与分析

2.1 降解木质素菌株筛选结果

2.1.1 菌株初筛 将采集的堆肥样品经过适当稀释涂布平板法接种到添加有铁氰化钾的筛选培养基中，结果表明，有11株菌在筛选培养基上呈黄绿色圈，即为阳性菌株。

2.1.2 LA-愈创木酚平板显色复筛 愈创木酚是具有木质素苯环结构特征的木质素类似物，可在菌落周围较快地形成鲜艳而均匀的红棕色氧化圈，且显色圈的直径和颜色可较好地反映Lac活性。本试验从11株菌中进行LA-愈创木酚平板显色反应筛选，分离到5株产Lac的细菌，其棕红色变色圈直径见表2。其中MZ-1、MZ-2、MZ-4、MZ-6、MZ-8、MZ-10不显色，其他5株菌株显色直径各不相同，MZ-3显色直径最小，其次是MZ-5、MZ-11、MZ-7，菌株MZ-9显色直径最大（3.01 cm）。

表2 各株菌的LA-愈创木酚平板显色试验结果

2.1.3 LA-苯胺蓝培养基平板退色复筛 苯胺蓝脱色法对木质素降解的锰过氧化物酶专一性强、效果明显。将从2.1.2中筛选出的5株显色菌进行LA-苯胺蓝培养基平板退色试验筛选，分离到2株产MnP的细菌（表3）。其中MZ-3、MZ-7、MZ-11不产生退色圈，菌株MZ-5退色直径为2.34 cm、MZ-9退色直径高达3.11 cm，因此选定菌株MZ-9为目标菌株。在某种程度上，退色圈的大小代表了菌株产木质素酶能力的强弱，但还需MZ-9菌株进行液体发酵培养进一步验证MZ-9菌株的产漆酶（Lac）和锰过氧化物酶（MnP）的活性以及木质素降解率。

表3 各菌株的LA-苯胺蓝培养基平板退色试验结果

2.2 MZ-9菌株液体发酵中的酶活性及木质素降解特性

2.2.1 Lac活性 由图1可知，MZ-9菌株可产Lac，且随着培养时间的延长Lac活性呈现先升高后下降的趋势，在培养5～8 d达到产酶高峰期、酶活性最高可达9.53 U/mL，随后下降较为明显，培养12 d后酶活下降至稳定。可见，MZ-9具有较强的产Lac特性。

图1 Lac活性变化

2.2.2 MnP活性 从图2可以看出，MZ-9菌株可产MnP，且随着培养时间的延长MnP活性先显著升高后显著下降，在培养6～10 d达到产酶高峰期、酶活性第8 d时达21.56 U/mL，随后下降至逐渐稳定。可见，MZ-9具有较强的产MnP特性。

图2 MnP活性变化

2.2.3 木质素含量及降解率 在菌种降解玉米秸秆过程中，大量的胞外酶可以降解外露的木质素。图3显示，降解木质素的含量先下降后趋于稳定，菌株MZ-9木质素降解率达到20.32%，说明MZ-9降解木质素能力较强。综上所述，MZ-9为降解木质素的最佳菌株。

2.3 菌株MZ-9的鉴定结果

将MZ-9菌株的序列片段在GenBank数据库进行Blast序列比对，用Clustalx软件进行同源性分析，并用MEGA6构建系统发育树。比对结果（图4）显示，MZ-9菌株与Bacillus licheniformis L15相似性高达99.2%。因此，确定菌株MZ-9为地衣芽孢杆菌。

菌株MZ-9的生理生化反应结果见表4，由表4可知，MZ-9革兰氏染色为阳性。产酸、酶学、明胶水解、柠檬酸盐利用、丙酸盐利用、酪素水解、V-P、淀粉水解等实验均为阳性，而卵黄卵磷脂酶实验为阴性。该菌在NaCl 0～10%、pH 6.0～9.0、温度20～45℃均能生长，其中NaCl 6%、pH 8.0、37℃为最适生长条件。这些生理生化特点与地衣芽孢杆菌极为相似，结合生理生化和分子生物学的鉴定结果，初步命名该菌株为B. licheniformis MZ-9。

图3 木质素含量的变化

图4 MZ-9系统发育树

表4 MZ-9菌株生理生化特性

图5 pH值对产MnP、Lac活性的影响

2.4 MZ-9菌株产MnP、Lac活性条件优化试验

2.4.1 pH值对产MnP、Lac活性的影响 从MZ-9菌株在不同pH值培养基培养下的结果（图5）可以看出，pH从5.0开始两种酶的活性逐渐升高，当pH值同时达到8.0时酶活性达到最高（MnP活性33.56 U/mL、Lac活性11.53 U/mL）；之后随着pH值的提高，木质素酶的活性呈缓慢下降趋势，表明木质素酶在偏碱性条件下活性稳定，能发挥良好的酶解作用。

2.4.2 培养温度对产MnP、Lac活性的影响 由图6可知，从25℃开始两种木质素酶的活性逐渐升高，当温度达到37℃时酶活性最高，其中MnP活性32.13 U/mL、Lac活性9.24 U/mL；之后随着温度的上升酶活性呈缓慢下降趋势，表明木质素酶在37℃条件下活性稳定，能发挥良好的酶解作用。

图6 培养温度对产MnP、Lac活性的影响

2.4.3 接种量对产MnP、Lac活性的影响 从接种量2%开始两种酶的活性随之逐渐升高，当接种量达到6%时酶活性最高，其中MnP活性32.51 U/mL、Lac活性10.54 U/mL；之后随着接种量的增加酶活性呈缓慢下降趋势（图7），表明木质素酶在接种量为6%的条件下活性稳定，能发挥良好的酶解作用。

图7 接种量对产MnP、Lac活性的影响

2.4.4 培养时间对产MnP、Lac活性的影响 图8表明，从培养6 d开始两种酶活性逐渐升高，当培养时间达6 d时Lac活性最高为10.23 U/mL，当培养时间达8 d时MnP活性达最高（32.14 U/mL），之后随着培养时间的延长酶活性呈缓慢下降趋势，表明木质素酶在培养5～8 d活性稳定，能发挥良好的酶解作用。

2.4.5 正交试验结果 从表5可以看出，在影响MnP活性的因素中，以培养温度的影响程度最大，其次是pH值和接种量，最优组合为A2B2C3D1，即pH值8.0、培养温度37℃、接种量8%、培养时间6 d。

从表6可以看出，在影响Lac活性的因素中，培养时间对Lac活性的影响最大，其次是培养温度和pH值，最优组合为A2B2C3D1，即pH 值8.0、培养温度37℃、接种量8%、培养时间6 d是MZ-9的最佳产酶条件。

综上所述，在影响MnP、Lac活性的因素中，培养时间和温度影响力较大。将MZ-9菌株接种于pH值8.0、培养温度37℃、接种量8%、培养时间6 d的条件下发酵，培养14 d后测得MZ-9木质素的降解率可达20.51%。

图8 培养时间对产MnP、Lac活性的影响

3 结论与讨论

堆肥法是环境工程中的一种利用自然界中天然存在的或经过人类改造的微生物对有机固体废物的氧化、分解能力，并在一定温度、湿度和pH值条件下使可降解有机固体废物发生生物化学降解，形成类似腐殖质土壤的物质，堆肥法的产物称为堆肥，堆肥可以为土壤提供大量腐殖质和以有机状态存在的丰富营养物质［20］。例如，席北斗等［21］发现，堆肥中木质素的降解微生物有放线菌和真菌，其中白腐菌是一种高效木质素降解微生物；张晓倩等［22］研究了添加木质素降解菌对堆肥中酶活性的影响，试验通过在堆肥中添加微生物菌剂，利用多种微生物的协调作用提高了堆肥温度，加快了堆肥腐熟，加速了堆料中各种有机质的降解，从而提高了堆肥的利用率。因此，堆肥是挖掘木质素降解菌的重要来源。戴芸芸等［23］发现，细菌生长快、结构简单、适宜在弱酸、弱碱条件下生长，在降解木质纤维素方面具有潜在应用前景，因此挖掘自然界中能降解木质纤维素的细菌有着重要意义。本试验通过研究堆肥中细菌对木质素的降解，筛选出一株能有效降解木质素的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）MZ-9，该菌降解木质素的最佳培养条件为pH 8、培养温度37℃、接种量8%、培养时间6 d时，在该条件下MZ-9菌株木质素降解率可高达20.51%。国内一些学者研究表明，地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌等对麦麸、麦秆、稻草等木质素的降解率最高为17.03%［24］。因此，菌株MZ-9在木质素降解方面具有很好的开发利用价值，可为后续的工业化生产提供可靠的菌种资源支撑。然而，MZ-9菌株对木质素的强降解作用依赖于Lac、MnP的产生，对有无其他关键酶系尚需进一步研究确定，希望利用MZ-9菌株结合真菌能开发出可商业化应用的木质纤维素生物降解技术，生成有价值的化工产品。

表5 影响MnP活性正交试验结果

表6 影响Lac活性正交试验结果

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（责任编辑 张辉玲）

Screening of lignin degradation strain MZ-9 and optimization of enzyme production conditions in compost

DENG Ao-yu1，GUAN Tong-wei1，WANG Peng-hao1，LI Zhi-qiang2，XIANG Hui-ping1，ZHAO Shun-xian1，ZHANG Xi-chao1
（1. Institute of Microbiology，Xihua University/key Laboratory of Food Biotechnology in Colleges and Universities in Sichuan Province，Chengdu 610039，China；2. Chengdu Huahong Biotechnology Co.，Ltd，Chengdu 611833，China）

This experiment use the potassium ferricyanide color，guaiacol color and aniline blue （Azure -B） fading circle method，and liquid fermentation experiment，measured enzyme activitives of Laccase （Lac） and Manganese Peroxidase （MnP） were as high as 9.53 U/mL，9.53 U/mL，lignin degradation rate was 20.32%，from the compost. An active strain MZ-9 is screened as a strong lignin degradation strain. Physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequence analysis showed that strain MZ-9 belonged to Bacillus and had 99.2% similar to Bacillus licheniformis. Enzyme production showed that when the pH value was 8.0，the culture temperature was 37℃，the inoculation amount was 8% and the culture time was 6 d，the Lac and MnP activities of strain MZ-9 were the highest，and the degradation rate of lignin was 20.51%. Therefore，strain MZ-9 is an excellent lignin degradation strain，has a very good development and utilization value in the lignin degradation，and can provide a reliable strain resource support for the subsequent industrial production.

compost；Bacillus licheniformis；Laccase （Lac） activity；Manganese Peroxidase （MnP） activity；lignin；biodegradation

Q93-331

A

1004-874X（2017）02-0095-09

2016-11-21

成都市农业技术研发项目（2015-NY02-00007-NC）；成都市高校人才创新服务项目（2015- RC03-00033-HZ）；成都市产学研联合实验室项目（2015-YF04-00052-JH，15205206）

邓奥宇（1992-），女，在读硕士生，E-mail：363214722@qq.com

关统伟（1978-），男，博士，副教授，E-mail：guantongweily@163.com

邓奥宇，关统伟，王鹏昊，等.堆肥中木质素降解细菌MZ-9的筛选及产酶条件优化［J］.广东农业科学，2017，44 （2）：95-103.