乳清雪菊酒发酵工艺优化的研究

张亚南，付二冬，刘伟，王沛，王威，古丽娜孜，田歌，吴浩天，马文瑞，张志臻，武运*

（1.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐830052；2.新疆农业大学科学技术学院，新疆乌鲁木齐830052）

乳清雪菊酒发酵工艺优化的研究

张亚南1，付二冬1，刘伟1，王沛1，王威1，古丽娜孜1，田歌1，吴浩天1，马文瑞1，张志臻2，武运1*

（1.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐830052；2.新疆农业大学科学技术学院，新疆乌鲁木齐830052）

为探讨乳清雪菊酒的加工技术，以新疆干酪副产物乳清与雪菊为原料，通过单因素试验与响应面试验设计优化乳清雪菊酒的发酵工艺条件。试验结果表明，乳清雪菊酒的最佳发酵工艺为：马克思克鲁维酵母菌∶酿酒酵母菌∶干酪乳杆菌的接种比例6%∶6%∶2%，发酵时间102 h，发酵温度30℃。在此条件下，乳清雪菊酒的酒精度可达5.93%vol，总酸为6.48 g/L，乳清雪菊酒呈淡橘黄色，拥有乳清与雪菊混合的芳香气味，乳香与花香协调，酒体柔和。

乳清；雪菊；酒精发酵；工艺优化

乳清是制造干酪和干酪素的加工副产物，具有较高的营养价值，其中约含乳清干物质6%～8%，粗蛋白质1%，粗脂肪0.3%～0.4%，总糖3%～5%（乳糖占99.8%），此外还含有矿物质和多种维生素[1-3]。其含有的乳清蛋白能结合钙以及一些疏水性分子（如视黄醇、维生素E），起到降血压、抗应激、降低痛苦刺激的灵敏度、降低胆固醇、提高免疫力、提高认知性能和改善睡眠等作用[4-6]；乳糖能促进肠道内钙、磷和锰等矿物质的吸收，抑制其他有害细菌的繁殖，调整菌群平衡[7]，但也易造成乳糖不耐症。目前，全世界乳清产量每年约180×106～190×106t，其中只有50%得到了利用[8]，其余大部分被作为废水直接排放，而据研究水污染的工作人员分析，由于乳清蛋白具有很高的生物需氧量（3800～46000mg/L），己远远超过200mg/L的生活污水容许极限[9]，对环境造成了较严重的污染。现今利用乳清生产含酒精饮料，具有工艺简单、设备要求低、产品附加值高等优点，乳清经过酵母菌和乳酸菌等发酵作用，产生乙醇、乳酸及其他有机酸类，不仅使饮料产生良好的风味，而且营养价值也大幅度提高了，这是由于乳酸菌将大分子乳清蛋白分解，产生一些肽类更易于被人体吸收。另外乳酸菌和克鲁维酵母菌能分解利用乳清中的乳糖，减少乳糖不耐症的发生。

雪菊学名两色金鸡菊，又称清三高花，是药食两用植物，含有多种黄酮类物质、多种人体必需的矿物元素、20多种氨基酸、数十种芳香族化合物、丰富的有机酸、维生素、酶类、多糖等，具有超过一般花茶的药理功效。将雪菊冲泡，香味浓郁，具有清热解毒、活血化疲、健脾胃、降血压、降血脂和降血糖之功效，还可治疗心慌、胃肠不适、食欲不振、痢疾等[10-13]，现已成为营养学家、药理学家以及养生专家研究的热点。

新疆是我国奶业发展较好的地区之一，随着奶酪需求量的增大，乳清排放量较大造成了资源浪费与环境污染。本研究以新疆乳清与雪菊为原料，将发酵液的酒精度作为评价指标，运用响应面法优化乳清雪菊酒的发酵工艺参数，以期为新疆乳清与雪菊的新产品开发和产品附加值的提高提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳清：新疆库尔勒瑞源乳业提供；雪菊：乌鲁木齐北园春市场；酵母菌、乳酸菌：新疆农业大学食品科学与药学学院微生物实验室提供；酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培养基、MRS培养基：青岛海博生物技术有限公司；其他培养基均购于新疆阜瑞克生物科技有限公司；酒石酸钾钠、硫酸铜、氢氧化钠、盐酸（均为分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

FA2014N分析天平：北京东南仪诚实验室设备有限公司；HR40-IIA2生物安全柜：青岛海尔特种电器有限公司；YXQ-LS-18SI手提式压力蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DHP-9052电热恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；YBFJ110酒精计：冀州市耀华器械仪表厂；WFI-J型手持测糖仪：成都豪创光电仪器有限公司；JM-L型胶体磨：上海诺尼轻工机械有限公司；TD5A-WS台式低速离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；NCJJ.1/100纳米超高压均质机：廊坊通用机械有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 工艺流程

1.3.2 操作要点

（1）原料处理：按照3 g/100 mL的比例将雪菊浸泡在无菌水中，获得雪菊溶液，同时将新鲜乳清，使用无菌纱布过滤除去杂质，并准确量取一定量的乳清加入10%的蔗糖。

（2）成分调整：将10%的雪菊溶液与90%的乳清溶液进行混合，置于85℃的水浴锅中，水浴30 min，冷却至室温。

（3）菌种活化：将保存于4℃冰箱中的斜面酵母菌与乳酸菌在无菌条件下接种于YEPD与MRS肉汤液体培养基中，将接种好的活化菌液，置于28℃活化培养24 h传代，活化2代后使用。

（4）酒精发酵：将酵母菌与乳酸菌按一定的比例加入乳清雪菊溶液中，30℃发酵4 d。

（5）将发酵完成的乳清雪菊酒加热至温度为50～70℃时，分别添加不同的稳定剂，经胶体磨处理2～3 min，再将处理后的样液在20MPa下均质10min，进行灌装，并于85℃条件下杀菌20 min，冷却储藏。

1.3.3 乳清雪菊酒发酵试验

（1）单因素试验

分别选取马克思克鲁维酵母菌、酿酒酵母菌和干酪乳杆菌的接种比例为3%∶3%∶5%、4%∶4%∶4%、5%∶5%∶3%、6%∶6%∶2%、7%∶7%∶1%，蔗糖添加量为6%、8%、10%、12%、14%，发酵温度为26℃、28℃、30℃、32℃、34℃，发酵时间为24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h，雪菊浸提液为10%、20%、30%、40%、50%进行单因素试验，测定发酵液的酒精度、总酸、可溶性固形物含量，研究不同单因素对乳清雪菊酒发酵过程的影响。

（2）响应面优化试验

根据单因素试验结果，采用Expert-Design8.05中的Box-Behnken的响应面设计，选取接种比例（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）为优化因素，以酒精度为响应值，对乳清雪菊酒发酵参数进行优化。响应面试验设计因素和水平见表1。

表1 乳清雪菊酒发酵条件优化响应面试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for wheyC.tintoriawine fermentation conditions optimization

1.3.4 检测指标

酒精度的测定：根据国标GB/T 23546—2009《奶酒》中测定方法[14]；酸度（以乳酸计）的测定：酸碱直接滴定法；可溶性固形物含量测定：采用手持测糖仪测定；微生物指标的测定：根据国标GB 4789.3—2010《食品安全国家标准食品卫生微生物学检验大肠菌群计数》规定的方法进行。

2 结果与分析

2.1 乳清雪菊酒发酵工艺单因素试验结果

2.1.1 不同菌种接种比例对乳清雪菊酒的影响

当发酵温度为30℃，发酵时间为96 h，蔗糖添加量为10%，雪菊溶液添加量为10%时，不同接种比例对乳清雪菊酒各指标的影响见图1。由图1可知，在不同的菌种接种比例下，乳清雪菊酒的酒精度呈现逐渐升高的趋势，可溶性固形物含量与总酸缓慢较低。当接种比例为6%∶6%∶2%时，酒精度达到最大值为5.7%vol，可溶性固形物含量下降为6.6°Bx，总酸下降为4.6 g/L；当接种比例为7%∶7%∶1%时，酒精度有所下降，而可溶性固形物与总酸基本不变。可能是因为菌种接种比例不同时，菌种的延滞期、起酵速度、发酵周期不同；菌种接种量较高时，菌种消耗大量营养物质进行了生长代谢，此时不利于酒精的转化[15]。综合考虑，选取菌种接种比例为6%∶6%∶2%进行发酵试验。

图1 不同接种比例对乳清雪菊酒的影响Fig.1 Effect of different inoculum ratio on whey C.tintoriawine

2.1.2 不同发酵时间对乳清雪菊酒的影响

在发酵温度为30℃，菌种接种比例为6%∶6%∶2%，蔗糖添加量为10%，雪菊溶液添加量为10%的试验条件下，不同发酵时间对乳清雪菊酒各指标的影响见图2。由图2可知，当发酵时间在24～96 h时，乳清雪菊酒的酒精度增加较快；发酵时间96 h时，酒精度达到最大值为6.3%vol，可溶性固形物为6.0°Bx，总酸为7.5 g/L，当发酵时间为96～144 h时，乳清雪菊酒的酒精度呈现缓慢下降趋势，可溶性固形物含量未变化，总酸呈现上升趋势，达到最大值为10.3 g/L。可能由于发酵时间较长，发酵液中营养物质不足，难以满足菌种的生长，进入衰亡期；也许是由于发酵时间较长，有大量的副产物累积，增加了菌种的抑制作用。综上所述，发酵时间选取96 h进行试验。

图2 不同发酵时间对乳清雪菊酒的影响Fig.2 Effect of different fermentation time on whey C.tintoriawine

2.1.3 不同发酵温度对乳清雪菊酒的影响

在菌种接种比例为6%∶6%∶2%，发酵时间为96 h，蔗糖添加量为10%，雪菊溶液添加量为10%的试验条件下，不同发酵温度对乳清雪菊酒各指标的影响见图3。由图3可知，当发酵温度在26～30℃，酒精度与总酸上升，可溶性固形物含量下降。当发酵温度为30℃时，发酵液的酒精度达到6.1%vol，可溶性固形物含量6.7°Bx，总酸为4.8 g/L。当发酵温度为30℃以上时，乳清雪菊酒酒精度出现下降现象，可溶性固形物含量缓慢上升。可能是因为发酵温度较低时，满足不了菌种的生长温度，使得菌种生长缓慢，起酵速度慢，发酵周期长；而发酵温度过高时，加速了菌种衰老，产酒精率低，同时易引起杂菌污染[16]。综上考虑，应选取发酵温度30℃进行发酵试验。

图3 不同发酵温度对乳清雪菊酒的影响Fig.3 Effect of different fermentation temperature on wheyC.tintoriawine

2.1.4 不同雪菊溶液添加量对乳清雪菊酒的影响

在发酵温度为30℃，发酵时间为96 h，菌种接种比例为6%∶6%∶2%，蔗糖添加量为10%的试验条件下，不同雪菊溶液添加量对乳清雪菊酒各指标的影响见图4。由图4可知，随着雪菊溶液添加量的增加，酒精度、可溶性固形物含量与总酸趋于稳定，对乳清雪菊酒的发酵特性影响不大，对乳清雪菊酒的风味影响较大，添加量过高时，雪菊香味过于浓郁，掩盖了乳香味，综合考虑，选择雪菊溶液添加量为10%，以保证乳清雪菊酒香味的协调性。

图4 不同雪菊溶液添加量对乳清雪菊酒的影响Fig.4 Effect of differentCoreopsis tintoriasolution addition on wheyC.tintoriawine

2.1.5 不同蔗糖添加量对乳清雪菊酒的影响

在发酵温度为30℃，发酵时间为96 h，菌种接种比例为6%∶6%∶2%，蔗糖添加量为10%，雪菊溶液添加量为10%的试验条件下，不同蔗糖添加量对乳清雪菊酒各指标的影响见图5。由图5可知，随着发酵液中糖含量的增加，乳清雪菊酒的酒精度显著升高；当糖添加量为10%时，酒精度达到最大值为6.02%vol，可溶性固形物含量为4.5°Bx，总酸为6.8 g/L；随着蔗糖添加量继续增加，乳清雪菊酒的酒精度有所下降，可溶性固形物含量随之升高，总酸下降。可能是当蔗糖添加量较低时，菌种生长和酒精转化的所需的碳源不足，酒精度较低；当蔗糖量过高时，形成了较高的渗透压，对菌种的生长与代谢起到了阻碍作用，并且随着发酵过程中酒精的积累，会加重对菌种代谢活动的阻碍[17]。综合考虑，选取蔗糖添加量为10%进行发酵。

图5 不同蔗糖添加量对乳清雪菊酒的影响Fig.5 Effect of different sucrose addition on whey C.tintoriawine

2.2 乳清雪菊酒发酵响应面优化试验结果

由单因素试验结果可知，试验所设计的考察因素对总酸影响较小，而对可溶性固形物与酒精度的影响较大，可溶性固形物与酒精度又呈现反比例关系，酒精度越高可溶性固形物就越低，因此选取酒精度作为响应面优化的评定指标，可体现出乳清雪菊酒的发酵特性。在此基础上，采用Box-Behnken进行响应面试验设计，考察菌种接种比例（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）对乳清雪菊酒酒精度（Y）的影响，试验设计及结果见表2。

对表2响应面试验结果进行回归分析，得到乳清雪菊酒酒精度对接种比例（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）的拟合方程为：Y=5.92+0.48A+0.16B+0.34C-0.20AB+0.10AC-0.12BC-0.85A2-0.42B2-0.67C2。

由表3可知，本实验建立的回归模型极显著（P＜0.0001）；而模型失拟项P=0.223 4＞0.05，说明模型失拟项不显著，由此说明所建立的模型具有良好的显著性。模型决定系数R2=0.992 1，校正决定系数R2Adj=0.981 9，表明该模型能较好拟合实际试验中响应值的变化，表明乳清雪菊酒酒精度的实测值与预测值之间具有良好的拟合度，能够利用该模型对乳清雪菊酒酒精发酵过程进行分析和预测。

表2 乳清雪菊酒发酵条件优化响应面试验设计结果与分析Table 2 Results and analysis of response surface methodology for wheyC.tintoriawine fermentation condition optimization

表3 回归方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equations

由表3可知，一次项A、B、C，交互项AB和二次项A2、B2、C2对响应值均存在极显著的影响（P＜0.01），交互项BC对响应值存在显著的影响（P＜0.05）。

2.3 响应面分析与优化

为了考察各个交互项对乳清雪菊酒的酒精度的影响，利用Design-Expert 8.05软件对回归模型进行响应面优化，并对交互作用显著的因素绘制交互项三维响应面图，能比较直观的解释各个变量和变量之间对响应值的影响，结果见图6。通过Design-Expert 8.05对建立的回归方程进行参数最优化分析，可以得出最佳发酵工艺条件为接种比例6.1%∶6.1%∶1.9%、发酵温度30.17℃、发酵时间102.33 h，在此条件下乳清雪菊酒酒精度预测值为6.04%vol。

图6 接种比例、发酵温度与发酵时间交互作用对乳清雪菊酒酒精度影响的响应面和等高线Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between inoculum ratio,fermentation temperature and time on alcohol content of wheyC.tintoriawine

2.4 验证试验

为检验该方法的可靠性，根据实际操作条件，将最佳发酵工艺修正为菌种接种比例为6%∶6%∶2%、发酵温度30℃、发酵时间102 h，经过3组平行试验，最终测得的样品平均酒精度为5.93%vol，可见该模型准确可靠，利用该模型在实践中进行预测是可行的。

2.5 产品质量指标

2.5.1 感官指标

乳清雪菊酒呈淡橘黄色，有少量的沉淀现象，拥有乳清与雪菊混合的芳香气味，无异味，酒体柔和。

2.5.2 理化指标

酒精度：5.93%vol，总酸：6.48 g/L。

2.5.3 微生物指标

致病菌：沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌未检出。

3 结论

在单因素试验的基础上，通过Box-Behnken响应面优化法，得出乳清雪菊酒最佳发酵条件为马克思克鲁维酵母菌∶酿酒酵母菌∶干酪乳杆菌接种比例6%∶6%∶2%，发酵时间102 h，发酵温度30℃。在优化的最佳条件下，所得的乳清雪菊酒酒精度可达5.93%vol，总酸为6.48 g/L，乳清雪菊酒色泽呈淡橘黄色，拥有乳清与雪菊混合的芳香气味，无异味，酒体柔和。

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Optimization of fermentation process of wheyCoreopsis tintoriawine

ZHANG Yanan1,FU Erdong1,LIU Wei1,WANG Pei1,WANG Wei1,GULINAZI1,TIAN Ge1,WU Haotian1,MA Wenrui1, ZHANG Zhizhen2,WU Yun1*
(1.College of Food Sciences and Pharmaceutical Sciences,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China; 2.College of Science and Technology,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China)

To research the technology of wheyCoreopsis tintoriawine,using whey(a by-product from Xinjiang cheese-making)andC.tintoriaas raw material,the optimum technological conditions were optimized through single factor experiments and response surface methodology.Experimental results showed that the optimum wheyC.tintoriawine fermentation process wereKluyveromyces marxianus∶Saccharomyces cerevisiae∶Lactobacillus caseiinoculum ratio 6%∶6%∶2%,fermentation time 102 h and temperature 30℃.Under the conditions,the alcohol content of the wine was 5.93%vol, total acid content was 6.48 g/L.The wheyC.tintoriawine was soft with pale orange color,had the aroma of whey mixed withC.tintoria,frankincense,coordinated with flowers.

whey;Coreopsis tintoria;alcoholic fermentation;process optimization

R284.2

0254-5071（2017）04-0109-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.023

2016-10-20

“十二五”国家科技支撑项目（2012BAD44B01-05）；企业横向合作项目（XJNDRY-002）；新疆农业大学自治区级大学生创新训练项目（201610758080）

张亚南（1990-），女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。

*通讯作者：武运（1965-），女，教授，硕士，研究方向为食品生物技术与食品安全。