坤宁安对去卵巢抑郁模型大鼠海马神经元凋亡的影响

王晓滨，郭琴琴，许贵军，王秀霞 ，班艳红*

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院,黑龙江 哈尔滨 150001;2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

坤宁安对去卵巢抑郁模型大鼠海马神经元凋亡的影响

王晓滨1，郭琴琴2，许贵军1，王秀霞2，班艳红1*

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院,黑龙江 哈尔滨 150001;2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

目的：观察坤宁安对去卵巢抑郁模型大鼠海马神经元凋亡的影响。方法：将去卵巢SD雌性大鼠50只，随机分为5组：对照组、模型组、坤宁安低剂量组、坤宁安高剂量组、氟西汀组，采用孤养结合慢性应激方式造模，观测坤宁安对大鼠海马神经元的影响。结果：抑郁模型大鼠海马的BDNF表达下调，神经凋亡细胞数增加，坤宁安可以减轻抑郁模型大鼠海马的BDNF表达下调及神经细胞的凋亡，坤宁安高剂量组、氟西汀组两组比较无统计学意义(P>0.05)。结论：坤宁安具有抗抑郁作用，其机理与能减轻抑郁模型大鼠海马BDNF表达的变化及减轻海马神经细胞凋亡相关。

坤宁安；海马；凋亡

抑郁症是临床上常见的精神疾患，一些临床资料提示抑郁症的发病与海马的体积变化有关[1]。海马神经元的损伤可能是诱发抑郁症的器质性基础[2]。本实验观察了坤宁安对去卵巢抑郁模型大鼠海马神经元的影响，现报道如下。

1 实验材料及方法

1.1 实验动物

健康SD大鼠，雌性，230～270 g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。大鼠适应性饲养1周后用水合氯醛(10%)腹腔注射麻醉,经脊柱旁切口摘除大鼠双侧卵巢，术后给予抗生素，正常喂养。以连续观察大鼠阴道脱落细胞1周未见动情周期为大鼠去势成功标准。术后4周开始造模。实验前对动物进行敞箱实验及强迫游泳试验，选择得分相近的50只大鼠随机分为5组：对照组、抑郁模型组、坤宁安低剂量组、坤宁安高剂量组、氟西汀组,每组10只。

1.2 造模方法

对照组正常饲养，不予刺激。其余大鼠单笼饲养，采用孤养结合慢性应激方式造模[3-4]，21天中每天选用下列刺激方法中的1种：禁食48 h、禁水24 h、止血钳夹尾1 min、4℃冷水游泳5 min、40℃5 min、电流(1 mA)电激足底30次(1次/min，10 s/次)、昼夜颠倒24 h、频闪仪闪光刺激(120次/min)。每种刺激大约选用2～3次，且不连续出现。

1.3 实验主要药品、给药剂量及方法

坤宁安：方中诸药由黑龙江中医药大学附属二院提供，水煎浓缩备用。氟西汀(礼来苏州制药有限公司分装):20 mg/粒。药物剂量按人、大鼠间换算公式计算，每日灌胃1次，于刺激前2 h灌服，共计21 d。坤宁安以临床等效剂量的1、4倍作为低、高剂量组换算剂量。氟西汀组给予氟西汀(溶于生理盐水中)，模型组给予生理盐水3 mL，对照组不予处置。

1.4 大鼠强迫游泳实验

方法参照文献稍加改进[5]，测试容器为圆柱形，直径30 cm，高60 cm，水深约为30 cm，实验时水温为23℃～25℃。在第1天和第21天分别进行5 min的测试游泳(24 h前对大鼠进行15 min的强迫游泳训练)，并记录大鼠除了避免没入水中而向上的运动外的静止不动时间。

1.5 组织取材

大鼠用10%水合氯醛腹腔内注射麻醉(0.4 mL/100 g)，打开胸腔，暴露心脏，用生理盐水、4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液先后心脏灌流，取脑组织用4%多聚甲醛溶液固定6 h后置于30%蔗糖溶液中，待组织下沉时取大鼠海马组织，石蜡包埋、切片。

1.6 检测

免疫组化法检测大鼠海马BDNF表达，Tunel法检测细胞凋亡。BDNF试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司。Tunel原位末端凋亡检测试剂盒，美国罗氏公司。用Image-pro plus 6.0病理图像分析系统分析。

1.7 统计分析

用SPSS16.0软件进行统计分析，组间差异采用方差分析。

2 结果

2.1 对去卵巢抑郁模型大鼠强迫游泳实验的影响

见表1。第1天强迫游泳实验各组大鼠相比无差异(P>0.05)。第21天，模型组大鼠静止不动时间延长，与对照组比较P<0.05。各用药组可不同程度缩短大鼠静止不动时间，与模型组比较P<0.05，中药高剂量组与氟西汀组比较无差异(P>0.05)。

表1 坤宁安对去卵巢抑郁模型大鼠强迫游泳实验的影响±s,s)

注：与对照组比较，★P<0.05;与模型组比较，▲P<0.05;与氟西汀组比较，*P<0.05;与坤宁安低剂量组比较，●P<0.05

2.2 对去卵巢抑郁模型大鼠海马BDNF表达的影响

见表2及图1。免疫组化法检测大鼠海马BDNF的表达，阳性表达主要在神经元细胞的胞质中，呈黄色或棕色，计算阳性细胞数。抑郁模型组大鼠与对照组比较P<0.05，BDNF阳性细胞表达下降。中药组可不同程度减轻这种变化，其中，中药高剂量组与模型组相比有差异(P<0.05)，与氟西汀组作用相近(P>0.05)。

表2 坤宁安对去卵巢抑郁模型大鼠海马BDNF表达的影响±s)

注：与对照组比较，★P<0.05;与模型组比较，▲P<0.05;与氟西汀组比较，*P<0.05;与坤宁安低剂量组比较，●P<0.05

2.3 对去卵巢抑郁模型大鼠海马神经细胞凋亡的影响

见表3及图2。Tunel法检测大鼠海马神经凋亡细胞数，阳性细胞细胞核呈棕黄色。结果提示模型组大鼠海马神经凋亡细胞数与对照组相比升高(P<0.05)；各用药组可减少抑郁模型大鼠海马细胞凋亡数(P<0.05)，坤宁安高剂量组与氟西汀组作用相近(P>0.05)。

图1 各组大鼠海马BDNF表达免疫组化图

图2 各组大鼠海马神经细胞凋亡Tunel检测图

表3 坤宁安对去卵巢抑郁模型大鼠海马神经细胞凋亡的检测±s)

注：与对照组比较，★P<0.05;与模型组比较，▲P<0.05;与氟西汀组比较，*P<0.05;与坤宁安低剂量组比较，●P<0.05

3 讨论

围绝经期是女性抑郁症的高发时期，此时女性在经历了经、孕、产、乳等生理过程后，精血耗伤较多，又值肾气渐衰，天癸渐竭，肝肾精血亏虚，水不涵木，肝失疏泄，气、血、阴、阳失于调和，所食水谷不归正化，反生痰浊瘀血，易导致抑郁症的出现。坤宁安是导师王秀霞教授临床经验方，对围绝经期的抑郁障碍有较好的临床疗效。本研究拟通过动物试验探讨坤宁安抗抑郁的作用机制。坤宁安由桂枝、白芍、龙骨、牡蛎、柴胡、当归、甘草等药物组成。方中桂枝甘草辛甘化阳，行血达荣；白芍甘草酸甘化阴，柔肝缓急；龙骨、牡蛎味涩质重，潜阳安神；柴胡、当归疏肝解郁，调和气血。诸药共用发挥疏肝解郁，调和阴阳、气血、营卫的作用。

研究表明，雌激素可影响中枢神经系统,与抑郁症的发生及治疗密切相关,当雌激素水平明显下降时，有可能导致女性抑郁发作，如绝经期女性及因双侧卵巢切除后月经停止者[6]。本研究采用去卵巢大鼠模拟女性雌激素水平低落状态，观察中药对去卵巢抑郁模型大鼠行为的影响。强迫游泳实验目前被广泛用于抗抑郁药的筛选与评价，大鼠在水中不动的时间可作为评价抑郁行为的指标。在本研究中，模型组大鼠在强迫游泳实验中不动时间的延长提示其出现抑郁行为，坤宁安可缩短模型大鼠在水中不动时间，说明其具有抗抑郁作用。

抑郁症的危害日益受到关注，但其发病机制至今尚未完全阐明[7-8]。抑郁症患者发病前常有应激性事件成为诱因。海马含有大量的皮质酮(CORT)受体，是下丘脑 - 垂体 - 肾上腺轴(HPA轴)应激反应的高位调节中枢，对应激反应敏感，但长期的过度应激会导致海马损伤，而海马神经元的损伤可能是诱发抑郁症的器质性基础[2]。一些临床资料提示抑郁症患者海马体积缩小，提示抑郁症的发病与海马的体积变化有关[1]。抑郁病人海马体积较之正常人显著减小,且减小程度与抑郁持续时间呈正相关[9]。有研究提示慢性应激可导致神经生长因子和凋亡抑制因子减少，同时海马神经元突触的可塑性降低[10]。应激性海马神经元的损伤和神经元再生障碍共同导致的海马等脑区神经元数量减少是抑郁症发生的关键环节，此二者均与cAMP-CREB通路功能及其介导的BDNF表达低下密切相关[11]。脑源性神经营养因子[12](BDNF)对神经元的生长、分化、存活及损伤后修复有重要的作用。抑郁症患者的血清BDNF水平低于正常对照人群，与病情的严重程度呈负相关。有自杀行为的抑郁症患者病势更加严重，血浆BDNF水平更低[13-15]。细胞凋亡[12]受细胞内的基因调控，其中Bcl-2基因家族是应激诱发细胞凋亡的主要相关基因。研究表明BDNF可通过调节 Bcl-2、Bax 蛋白的表达，从而抑制神经细胞凋亡[16]。在本研究中，模型组海马脑区的BDNF表达降低，神经细胞凋亡增加，说明模型大鼠的抑郁样行为与海马的损伤相关。坤宁安能够减轻抑郁模型大鼠海马BDNF表达下降，减轻其海马神经细胞凋亡，说明坤宁安具有抗抑郁作用，其机制与保护海马神经元、从而维持海马正常调节应激反应的功能相关。

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2016-12-07

2017-02-19

黑龙江省自然科学基金项目(D200962)

王晓滨(1970-)，女，博士，主任医师，研究方向:中西医结合防治绝经相关疾病。

*通讯作者：班艳红(1969-)，女，博士，副主任医师，研究方向:中西医结合防治绝经相关疾病。

R285.5

A

1002-2392(2017)02-0043-03