穿心莲煎剂对变应性鼻炎大鼠Th1/Th2细胞调节的研究

白强，颜利晶，李玲，谭琥，谭程丹，宁状状， 王慧婷，靳皓文，吴东升

(1.湖南中医药大学中西结合学院，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学中医学院，湖南 长沙 410208)

实 验 研 究

穿心莲煎剂对变应性鼻炎大鼠Th1/Th2细胞调节的研究

白强1，颜利晶1，李玲2*，谭琥1，谭程丹1，宁状状1， 王慧婷1，靳皓文1，吴东升1

(1.湖南中医药大学中西结合学院，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学中医学院，湖南 长沙 410208)

目的：探讨穿心莲煎剂干预治疗变应性鼻炎的效果及可能作用机制。 方法：建立豚鼠变应性鼻炎模型，实验设空白组、模型组，穿心莲组、西替利嗪组和联合用药组，并给予相应药物灌胃干预。运用HE染色、ELISA、RT-PCR法分别观察各组动物鼻腔黏膜和肺组织病理学变化、血清中细胞因子的含量及肺组织中Tim1、Tim3的mRNA表达。 结果：穿心莲煎剂、西替利嗪和两者联合用药均能不同程度降低变应性鼻炎豚鼠症状学积分；改善鼻腔黏膜、肺组织、肺泡灌洗液的炎症程度；上调血清中INF-γ含量，下调IL-4含量；下调肺组织中Tim1、Tim3的mRNA表达，且联合用药组效果最为显著。结论：穿心莲煎剂能够通过干预Th1/Th2细胞亚群平衡，进而改善鼻腔黏膜和肺组织的变应性炎症，且与西替利嗪联合用药效果更为显著。

穿心莲；变应性鼻炎大鼠；Th1/Th2细胞亚群平衡

变应性鼻炎(allergicrhinitis，AR)，生活中常称为过敏性鼻炎，是特异性个体接触特异性变应原后由免疫球蛋白(IgE)作为中间介质引起炎性介质释放并作用于效应器官鼻黏膜的非感染性慢性炎症，患者特征性表现为鼻痒、阵发性喷嚏、大量水样鼻涕、鼻塞、鼻黏膜肿胀、特异性IgE和嗜酸性粒细胞增多等特点。多数变应性鼻炎患者在病程中会有身体疲惫、情绪易波动、睡眠障碍等情况出现，更甚者出现心理疾患，如抑郁症、焦虑症和酗酒等，对于幼儿则有多动症、睡眠障碍等不良影响[1-2]。近年来，该病在全球范围内的发病率有上升的不良势头，是严重困扰广大患者的常见、易复发的难治病。

穿心莲具有清热解毒、凉血消肿健脾等功效，是近几年来发现临床治疗变应性鼻炎有效的药物之一，现代研究表明，穿心莲提取物穿心莲内酯具有抑制和调节抗炎、抗过敏效应，可以应用于变应性疾病的防治，并具有良好的推广前景。但是，该物质对于I型变态反应的作用机制仍然处于探索阶段，尤其是针对变应性鼻炎的防治效应尚未得到充分研究，为进一步研究穿心莲对AR的作用及其作用机制，本实验检测了穿心莲煎剂对变应性鼻炎豚鼠动物模型Th1/Th2细胞亚群平衡调节的作用，推断其可能的作用机制，现将实验结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验仪器

超净工作台(郑州宏朗仪器设备有限公司，SW-CJ-1F)，电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司，FA-1104)，-80℃低温冰箱(日本SANYO)，台式高速冷冻离心机(湘仪离心机仪器有限公司，TGL-20M)，光学扫描显微镜+moticcam2306摄像头(ZEISS)，酶标仪(美国，Bio-tek)，图像分析软件(Motic Advanced 6.0)等。

1.2 实验试剂

卵清蛋白(Sigma公司，批号：9006-59-1，美国),氢氧化铝(北京北瑞达医药科技有限公司，中国),水合氯酸(北京化学试刺公司，分析纯，中国),切片石蜡(北京北化康泰临床试剂有限公司，批号：20071106，中国),无水乙醇(北京化学试剂公司，批号：070316，分析纯，中国),琼脂糖(西班牙),Trizol(Invitrogen),DEPC(Sigma),EDTA(由美国公司提供)、逆转录试剂盒(Fermentas),Taq酶(Genstar),引物(上海生工),DL2000DNA Marker(Genstar),dNTP(Genstar),E.B.(Sigma),IL-4 ELISA试剂盒( Ambion， ybA077Gu),INF-γELISA试剂盒(Wksubio，ABE40031)。

1.3 实验药物

穿心莲饮片购自湖南中医药大学第一附属医院门诊药房，浓煎为浓度为1 g/mL生药，4℃保存，备用。西替利嗪：批号H20000138，10 mg×6片。

1.4 实验动物

6～8周龄清洁级健康豚鼠，共50只，雄性，体质量250～300 g，由湖南中医药大学动物中心提供,并提供动物实验室，许可证号： SYXK(湘)2013-0005。实验期间，自由进食饮水。

1.5 实验分组

健康清洁级豚鼠50只，以随机数字表法分为5组，即空白对照组(A组)、模型对照组(B组)、穿心莲组(C组)、西替利嗪(D组)、穿心莲和西替利嗪联合用药组(E组)，每组10只。

1.6 变应性鼻炎动物模型建立

1.6.1 基础致敏

模型组采用卵清蛋白(OVA)致敏的方法以30 mg卵清蛋白作抗原，氢氧化铝粉末3 g作佐，加生理盐水100 mL制成混悬液，每只豚鼠1 mL腹腔注射，隔日1次，共7次，为基础致敏。

1.6.2 局部激发致敏

自实验第15天开始鼻部激发，用2%卵清蛋白滴击双侧鼻腔，每侧40 μL，每曰1次，共7次。空白对照组用相应等量的生理盐水代替卵清蛋白及氢氧化铝腹腔注射和滴鼻，方法同上。

1.6.3 模型判定标准

采取记分法记录鼻分泌物量、喷嚏次数及鼻痒程度。即在豚鼠鼻腔末次激发后，立即对其观察30 min，观察豚鼠喷嚷、清满及搔鼻动作，各项指标采取叠加量化记分，总分超过5分为动物造模成功。记录方法见表1。

1.7 动物给药方法

按照《药理试验方法学》中动物间和动物与人体间的等效剂量换算方法，以60 kg的成人为标准，依据临床用药量，参照体表面积计算法计算其给药剂量并予以灌胃。

表1 造模记录方法

A组：予生理盐水等量于中药灌胃：2 mL/(2次·d)，共给药14次。

B组：予生理盐水等量于中药灌胃：2 mL/(2次·d)，共给药14次。

C组：予穿心莲煎剂以60 kg的人为标准：5.57 g/kg，2 mL/(2次·d)，共给药14次。

D组：予西替利嗪以60 kg的人为标准：0.01 g/kg，2 mL/(2次·d)，共给药14次。

E组：予穿心莲煎剂11.14 g/kg，1 mL/(2次·d)，西替利嗪0.02 g/kg，1 mL/(2次·d)，共给药14次。

1.8 观察指标及方法

①各组豚鼠实验前后行为学计分比较;②鼻腔黏膜组织病理诊断： 运用常规HE法观察比较各组动物鼻腔黏膜组织病理学变化程度及嗜酸性粒细胞密度;③血清中Th1/Th2型细胞因子的分泌水平：运用ELISA法检测血清中Th1型细胞代表性因子INF-γ及Th2细胞代表性因子IL-4的含量;④鼻腔黏膜中Tim1、Tim3的mRNA表达情况：运用RT-PCR法检测鼻腔黏膜中Tim1、Tim3的mRNA表达情况。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 各组豚鼠实验前后行为学计分比较

如表2所示，各组药物干预前后鼻部症状积分的比较结果显示,模型对照组症状学积分均>5，较空白对照组症状积分明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)，提示AR模型造模成功；各药物组经药物干预后症状积分均明显下降，较药物模型对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)。

2.2 HE法鼻腔黏膜组织、肺组织、肺泡灌洗液病理学变化程度

表2 各组药物干预前后鼻部症状积分的比较±s,n=10)

注：与药物干预前比较，##P<0.01；与空白对照组比较，**P<0.01；与模型对照组比较，△△P<0.01

豚鼠鼻黏膜病理结果显示：空白对照组(图1A)可见鼻黏膜结构完整，黏膜下层未见明显血管扩张，未见炎性细胞浸润；模型对照组(图1B)大量炎细胞浸润、鼻黏膜上皮脱落严重且伴有充血，提示AR模型造模成功。各药物组(图1C、D、E)鼻黏膜轻度炎症，偶见上皮脱落及细胞充血现象，提示药物干预有一定疗效。豚鼠肺组织病理结果显示：空白对照组(图2A)豚鼠肺组织结构完整，无明显增生，未见炎性细胞浸润；模型对照组(图2B)可见大量炎性细胞浸润、肺间质增生、少量充血，见多处淋巴结节，提示AR模型造模成功。各药物组(图2C、D、E)肺部轻度炎症、少量充血，有少量间质增生、淋巴结节现象。提示药物干预有一定疗效。豚鼠肺泡灌洗液病理结果显示：空白对照组(图3A)豚鼠肺泡灌洗液中未见炎性细胞；模型对照组(图3B)可见大量炎性细胞和嗜酸性细胞增多，提示AR模型造模成功。各药物组(图3C、D、E)轻度炎症提示药物干预有一定疗效。

图1 豚鼠鼻黏膜病

A.空白对照组;B.模型对照组；C.穿心莲组;D.西替利嗪组；E.联合用药组

2.3 ELISA法检测血清中INF-γ、IL-4含量

表3 各组血清中INF-γ、IL-4含量的比较

注：与空白对照组比较，**P<0.01；与模型对照组比较，△△P<0.01；与联合用药组比较，#P<0.05，##P<0.01

如表3所示，ELISA法检测血清中Th1型细胞因子INF-γ、Th2细胞因子IL-4的含量结果显示：模型对照组血清总INF-γ低于空白对照组，IL-4高于空白对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)，提示AR豚鼠模型Th1细胞因子表达下降，Th2细胞因子表达量增加，Th1/Th2细胞因子网络失衡，从而加重变态炎症性反应；各药物组豚鼠血清中INF-γ明显上调，IL-4明显下调，与模型对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)，提示经药物干预治疗Th1细胞因子表达呈增加趋势，Th2细胞因子表达量呈减少趋势，Th1/Th2细胞因子趋于恢复平衡，变态炎症反应减轻，从而使AR症状减轻或缓解；其中联合用药组调控Th1/Th2细胞因子的效果优于穿心莲或西替利嗪单用药，差异具有统计学意义(P<0.01，P<0.05)，提示穿心莲联合西替利嗪共同用药优于穿心莲或西替利嗪单独用药。

2.4 RT-PCR法Tim1、Tim3的mRNA表达情况

如表4所示，RT-PCR法检测血清中Tim1、Tim3 mRNA表达情况结果显示：Tim1、Tim3蛋白在AR模型豚鼠中广泛表达，与空白对照组进行比较差异具有统计学意义(P<0.01，P<0.05)，提示Tim1、Tim3 mRNA表达可能参与变应性鼻炎的发生和发展；西替利嗪组及联合用药组Tim1、Tim3表达较模型对照组表达下降，差异具有统计学意义(P<0.01，P<0.05)。

表4 各组Tim1、Tim3 mRNA表达(2-△△ct)的比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型对照组比较，△P<0.05，△△P<0.01

3 讨论

变应性鼻炎，又称变态反应性鼻炎(allergic rhirtitis，AR)、过敏性鼻炎，中医称“鼻鼽”，是临床严重困扰广大患者的临床常见、发病率高且易复发的难治病之一。根据病邪的性质我们将鼻鼽的病因区别为内因和外因，内因多为肺、脾、肾三脏功能失调，外因多为风寒疫气入侵。现代研究认为变应性鼻炎主要表现为某些易感特异性个体对某些变应原敏感性增高而导致的鼻腔黏膜的变态反应性疾病，其实质为特异性个体接触特异性变应原后由免疫球蛋白(IgE)作为中间介质引起炎性介质释放并作用于效应器官的鼻黏膜非感染性慢性炎症反应，患者除表现为鼻痒、喷嚏、鼻涕等症状外还特征性表现为鼻黏膜肿胀、特异性IgE和嗜酸性粒细胞增多等特点。变应性鼻炎严重影响患者生活质量，导致劳动力的丧失，患病率为10%～25%，已成为全球性普遍存在的疾患[3-4]，且发病率有全球性逐年增加的趋势，现在已经成为国际关注性疾病[5]。

近几年的研究发现变应性鼻炎(AR)的发病机制与Th1/Th2细胞因子比例失去平衡紧密相关，常表现为Th2细胞因子表达量显著增加，Th1细胞因子表达下降。Th1主要产生IL-2、IFN-γ、TNF-α、TNF-β，Th2细胞主要产生IL-4、5、10、13、TNF-α等细胞因子，通过调节B淋巴细胞，进而使其合成IgE抗体，促进炎症细胞的浸润，促进嗜酸性粒细胞(EOS)的增殖、分化、趋化和活化，Th2增殖所需细胞因子为IL-2、IL-4，其中形成IgE、IgA对Th2增殖起辅助作用，Th1对Th2的增殖抑制作用[6-7]。因此IL-2、IFN-γ可反映Th1细胞的表达水平,IL-4、IL-5可反映Th1细胞的表达水平[8]。

主要增强吞噬细胞介导的抗感染免疫的Th1产生的IFN-γ是重要抗炎因子，是巨噬细胞活化必不可少的细胞因子，它能使吞噬细胞吞噬和杀伤病原体的活力增强，同时促进IgG的生成[9]。IFN-γ能够抑制IL-4诱导的IgE的合成，从而抑制体内IgE的生成[10]。相关研究还发现，AR患者存在Th2细胞因子IL-4等分泌增多，同时出现局部嗜酸性粒细胞浸润[11]。IL-4 是Th2 细胞因子的典型代表，在变应性炎症中的作用广泛，包括介导IgE的生成、嗜酸性粒细胞的成熟、肥大细胞的生长、气道的高反应性及黏液的大量生成等[12]，同时IL-4还是专属的IgE同型转换因子，它可以促进免疫球蛋白类转换为IgG和IgE[13]；并且刺激IgE的基因重组和IgE的信使RNA 的转录，从而增强B细胞的IgE产生，使免疫系统对小量抗原刺激发生免疫应答[14]。

Tim1主要表达在Th2细胞和活化的初始T细胞表面，协同刺激T细胞增殖，并促进细胞因子的分泌，在调节Th2细胞的增殖、分化和分泌细胞因子中发挥重要作用，主要作用于一些过敏性疾病和自身免疫性疾病；而Tim3是一种与T细胞功能有关的表面分子，分子选择性地表达在活化的Th1细胞表面而不表达在Th2细胞表面，与其配体结合后，抑制Th1型免疫应答起负性免疫调节作用[15-17]。

穿心莲为穿心莲属植物，具有清热解毒、凉血消肿健脾等功效，现代研究表明，穿心莲提取物穿心莲内酯具有抑制和调节树突状细胞和其他免疫细胞合成或分泌炎性介质和细胞因子活性的作用，如脂多糖(LPS)、NO(一氧化氮)、PEG2(前列腺素2)、IL-1(白介素1)、IL-5(白介素5)、LTB4(白三烯B4)、TXB2(血栓素B2)及组胺等，从而具有抗炎、抗过敏效应，可以应用于变应性疾病的防治，并具有良好的推广应用前景。但是，该物质对于I型变态反应的作用，尤其是变应性鼻炎的防治效应尚未得到充分研究，值得进行探讨。

本研究结果提示：AR模型豚鼠症状学积分均>5，较空白对照组症状积分明显升高，鼻腔黏膜组织有大量炎细胞浸润、鼻黏膜上皮脱落严重且伴有充血，肺组织亦可见大量炎性细胞浸润、肺间质增生、少量充血，见多处淋巴结节，肺泡灌洗液中也存在大量炎性细胞和嗜酸性粒细胞，血清中INF-γ低于空白对照组，IL-4高于空白对照组，Th1/Th2细胞因子网络失衡，从而加重变态炎症性反应。Tim1、Tim3mRNA在AR模型豚鼠中广泛表达，提示Tim1、Tim3可能参与变应性鼻炎的发生和发展；而穿心莲煎剂以及穿心莲煎剂与西替利嗪联合用药，能减轻鼻腔黏膜组织、肺组织和肺泡灌洗液的病理改变程度，血清中Th1细胞因子INF-γ含量有所上调，Th2细胞因子IL-4含量有所下调，Th1/Th2细胞因子趋于恢复平衡，变态炎症反应减轻，从而使AR症状减轻或缓解，Tim1、Tim3mRNA表达也有所下调，一定程度上缓解了变应性鼻炎的发生和发展；其中联合用药组调控效果优于穿心莲或西替利嗪单用药。

综上所述，笔者认为穿心莲煎剂可能通过调节Th1/Th2细胞亚群平衡及Tim1、Tim3的表达，进而改善过敏性鼻炎的变态炎症性反应，尤其与西药西替利嗪联合使用的效果更为明显，为中西医结合治疗过敏性鼻炎提供了一定的实验依据，而两者协同作用的机制还有待进一步研究。

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Study on the Regulation of Thymus Decoction on Th1/Th2 SystemCytokines in Guinea Pig with Allergic Rhinitis

BAI Qiang1, YAN Li-jing1, LI Ling2, TAN Hu1, TAN Cheng-dan1, NING Zhuang-zhuang1,WANG Hui-ting1, JIN Hao- Wen1, WU Dong-sheng1

(1.CollegeofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China;2.CollegeofTraditionalChineseMedicine,HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China)

Objective: To explore the effect and possible mechanism of Andrographis decoction in the treatment of allergic rhinitis. Methods: All guinea pigs were randomly divided into five groups, blank group, model group, Andrographis group, cetirizine group and combination group. Then we treated these groups with the appropriate drug lavage intervention. HE, ELISA, RT-PCR were used to observe the pathological changes of nasal mucosa and lung tissue, the content of cytokines in serum and the mRNA expression of Tim1 and Tim3 in lung tissue of each group. Results: Andrographis decoction, cetirizine and the combination of the two different drugs all could inordinately reduce the degree of allergic rhinitis symptom score in guinea pigs ,improve the inflammation of nasal mucosa, lung tissue and bronchoalveolar lavage fluid, and up-regulate serum INF-γ content and down-regulate IL-4 content. Finally, we found that the combination group had the best effect. Conclusion: Andrographis decoction can improve allergic inflammation in the nasal mucosa and lung tissue by intervening Th1/Th2 cell subsets, and the effect of combination of Andrographis paniculata decoction and cetirizine is much better.

Andrographis; Allergic rhinitis rats; Th1/Th2 cell subsets equilibrium

2016-05-24

2016-10-30

国家自然科学基金项目(81503445；81473468)；湖南省卫生计生委科研课题(C2015-16；C2016049)；湖南省教育厅一般项目(15C1032)；高校国家级大学生创新创业训练计划项目(201510541009)；湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目(No.2015-211)；湖南省高校科技创新团队“感染性疾病中医药防治研究”资助项目(No.15)

白强(1994-)，男，中西结合七年制学生，主要从事中医药抗感染性疾病的机理研究。

*通讯作者：李玲(1983-)，女，硕士，实验师，主要从事中医药抗感染性疾病的机理研究。

R285.5

A

1002-2392(2017)02-0001-05