蜂胶中短叶松素的提取分离与含量测定*

2017-04-24文萍刘雯张娣康明陈乐

实用中西医结合临床 2017年1期

关键词：液相色谱仪蜂胶供试

文萍刘雯张娣康明陈乐

（江西省中医药研究院南昌 330046）

蜂胶中短叶松素的提取分离与含量测定*

文萍刘雯张娣康明陈乐#

（江西省中医药研究院南昌 330046）

目的：研究蜂胶中短叶松素的制备工艺及含量测定方法，并测定和比较12个产地蜂胶中短叶松素的含量。方法：采用溶剂提取、大孔树脂吸附及葡聚糖凝胶色谱和重结晶等方法进行分离纯化，根据理化性质和核磁数据对化合物进行结构鉴定为短叶松素；用HPLC法测定蜂胶中短叶松素含量，YMC C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速为1.0 m l·m in-1，甲醇-0.1%磷酸溶液（60∶40），检测波长：292 nm。结果：所得短叶松素的纯度在98.5%以上，短叶松素在8.512～425.6 μg线性关系良好，平均回收率（n=6）为98.60%，RSD为0.97%，12个产地的蜂胶中短叶松素以新疆、云南、陕西三地含量较高。结论：提取分离的短叶松素含量高，可作为含量测定用对照品，含量测定方法稳定、可靠，可作为蜂胶中短叶松素含量测定方法。

蜂胶；短叶松素；提取分离；含量测定

蜂胶具有抗过敏、抗炎、抗氧化、强化血管、抑制病毒、抗肿瘤、增强机体免疫力等保护身体健康、抵御疾病入侵的作用[1～2]。蜂胶中含有丰富的黄酮类[3]等生物活性成分，具有极为丰富的药理活性。短叶松素及其衍生物具有强化血管、抗菌、抗炎、抗氧化作用[4～5]，还具防止肝功能损伤、保肝护肝的作用[6]，也是发挥蜂胶功效的物质基础之一。蜂胶的分布非常广泛，不同产地的蜂胶中各成分含量参差不齐[7]。本文采用简单有效的方法提取分离出蜂胶中的短叶松素，并采用高效液相色谱法对12个产地的54批蜂胶中短叶松素含量进行了测定和比较，为蜂胶质量标准的制定及资源开发利用提供参考依据。现报告如下：

1 仪器与试药

1.1 仪器旋转蒸发仪（Eyela公司），低温循环水式真空泵（郑州长城科工贸有限公司），Waters 1525-2487-2707型高效液相色谱仪，TU-1810型紫外可见分光光度仪（北京普析通用仪器有限责任公司），中压液相色谱仪（Brucker公司），400 MHz和600 MHz核磁共振仪（Varian公司），M icromass Auto specultima ETOF型质谱仪，CQ-250超声波清洗器（上海船舶电子设备研究所），MettllerTkledoAG135双量程电子天平（十万分之一），SimplicityTM超纯水系统（M illipore公司）。

1.2 药品与试剂蜂胶为课题组收集云南（样品编号16、17）、四川（编号35、37、38）、江西（编号90、99、103、104、106）、湖南（编号110、111、117、118、119）、山东（编号128、129、142、151）、河南（编号27、28、30、43、45、46、47）、山西（编号49、50、52、57）、内蒙（编号130、134、136）、辽宁（编号53、138）、陕西（编号1、2、4、6、9）、甘肃（编号10、15）、新疆（编号31、41）、浙江（编号86、87、88、89）等地48个蜂胶及汪氏蜜蜂园有限公司提供的6批蜂胶，经江西省中医药研究院余良忠研究员鉴定为蜜蜂Apis ceranaFabr.将采自植物的枝条、叶芽及愈伤组织等的分泌物与上腭腺、蜡腺等的分泌物同少量花粉混合后所形成的黏性物质。短叶松素对照品（自制，纯度98.69%），AB-8型大孔吸附树脂（沧州宝恩吸附材料科技有限公司），葡聚糖凝胶Sephadex LH-20、CG161型大孔树脂（美国罗门哈斯公司），甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 短叶松素的提取分离参考文献[8]称取蜂胶原料约200 g，置于冰箱冷冻层24 h后，用粉碎机粉碎，过1号筛，加入1 000 m l的95%乙醇，振摇提取2次，每次提取4 h，滤过，回收乙醇，浓缩，真空干燥（80℃，-0.1 MPa）12 h，得蜂胶提取物。取蜂胶提取物倒入圆底烧瓶，加入200 m l 95%乙醇回流，至蜂胶提取物全部溶解。将蜂胶提取物乙醇溶解减压浓缩至适宜浓度，湿法上样，上大孔吸附树脂柱。甲醇-水溶剂系统（1∶10、2∶10、3∶10、4∶10、5∶10、10∶0）梯度洗脱，收集各段的洗脱液2 000 m l，按极性大小分为A、B、C、D、E、F。取D洗脱液，浓缩，将浓缩液上Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱。甲醇-水溶剂系统（1∶10、2∶10、3∶10、4∶10、5∶10、10∶0）梯度洗脱，收集各段的洗脱液2 000 m l，按极性大小分为AA、BB、CC、DD、EE、FF。组分CC经硅胶柱（石油醚-丙酮2∶1）及制备液相（40%～70%）得化合物（1 g）。经高效液相色谱归一法测定，其纯度＞98.5%。

2.2 短叶松素的结构鉴定淡黄色针状结晶（甲醇）。1H-NMR（600 MHz,DMSO-d6）δ：11.89（1H,s, 5-OH），10.85（1H,s,7-OH），5.85（1H,d,J=6.6 Hz, 3-OH），7.38～7.53（5H,m,B环上的H），5.90（1H,d, J=1.8 Hz,H-6），5.94（1H,d,H-8），4.64（1H,dd,J= 11.4,6.0 Hz,H-3），5.19（1H,d,J=11.4 Hz,H-2）。13C-NMR（150 MHz,DMSO-d6）δ：83.4（C-2），72.0 （C-3），198.1（C-4），163.8（C-5），96.7（C-6），167.4 （C-7），95.6（C-8），163.0（C-9），101.0（C-10），137.8 （C-1′），128.6（C-2′,6′），128.7（C-3′,5′），129.1（C-4′）。以上数据与文献报道[9]一致，故鉴定为短叶松素（pinobaksin）。

2.3 短叶松素的含量测定

2.3.1 色谱条件的选择取对照品短叶松素约10 mg，精密称定，置25 m l量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为400 μg·m l-1的对照品溶液。精密吸取上述溶液1 m l于10 m l容量瓶中，加甲醇至刻度摇匀。取上述对照品溶液置紫外分光光度计上进行光谱扫描，在292 nm有明显吸收峰。结果见图1。色谱条件选择YMC C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速为1.0 m l·m in-1，检测波长：292 nm，按甲醇-0.1%磷酸溶液（60∶40）进行洗脱，结果蜂胶分离峰型好，分离度满足液相色谱要求。见图2、图3。

图1 短叶松素紫外光谱图

图2 短叶松素对照品色谱图

图3 蜂胶供试品色谱图

2.3.2 供试品溶液的制备取蜂胶药材约50 mg，精密称定，至25 m l容量瓶中，加甲醇适量，超声处理15 min取出，放置至室温，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，作为供试品溶液。

2.3.3 线性关系的考察取对照品短叶松素约10.64 mg，精密称定，置25 m l量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀得浓度为425.6 μg·m l-1的对照品溶液。将此对照品溶液分别稀释至1 m l含8.512、17.024、34.048、42.560、85.120 μg短叶松素的溶液。精密吸取上述短叶松素对照品溶液各10 μl，注入液相色谱仪中，在292 nm波长处测定其峰面积，将浓度对峰面积值进行回归，回归方程为Y＝61 451.82X+22 195.95（R2＝0.999 9），短叶松素在进样量8.512～425.6 μg，与峰面积值呈良好的线性关系。

2.3.4 精密度试验精密吸取同一供试品溶液10 μl，注入液相色谱仪中，重复进样6次，在292 nm处测定其峰面积，经数据分析，RSD＝1.39%。

2.3.5 稳定性试验精密吸取同一供试品溶液10 μl，在不同时间点0、2、4、8、12、24 h注入液相色谱仪中，分别测定短叶松素峰面积，经数据分析，RSD＝1.23%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.6 重复性试验取同一批蜂胶药材共6份，测定短叶松素平均含量为0.60%，RSD＝0.01%。

2.3.7 回收率试验取蜂胶供试品约25 mg共6份，精密称定，置25 m l量瓶中，分别精密加入短叶松素对照品溶液5 m l（1 m l含短叶松素42.56 μg），加入适量甲醇，超声处理15 m in，取出，放置至室温，加甲醇至刻度，摇匀，微孔滤膜（0.45 μm）滤过，注入液相色谱仪测定短叶松素含量，计算回收率。见表1。

表1 回收率试验结果

2.4 样品中短叶松素和咖啡酸的含量测定取54批蜂胶样品，按上述方法测定其短叶松素含量。见表2。

表2 合格蜂胶中短叶松素测定结果

3 讨论

本文以蜂胶中短叶松素为研究对象，考察其提取分离技术，成功在蜂胶中分离出短叶松素。从本文表2测定结果可知，54批合格蜂胶短叶松素的含量范围为0.95%～3.85%，平均含量为1.85%，结合本项目前期研究测得结果[10]，规定蜂胶中短叶松素含量不得低于0.95%。由表2实验结果可以看出各地蜂胶中短叶松素平均含量有显著差异，云南2.42%、四川2.02%、江西1.48%、湖南1.77%、山东1.73%、河南2.30%、山西2.11%、内蒙1.66%、辽宁1.09%、陕西2.42%、甘肃1.63%、新疆2.66%，其中以新疆、云南、陕西三地含量最高。汪氏蜜蜂园有限公司提供的6批蜂胶中短叶松素平均含量为1.69%，也在合格范围内。通过对12省54批蜂胶药材中短叶松素的含量测定和比较，规定了短叶松素含量下限，为以后蜂胶质量和资源开发利用提供参考依据。

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10.13638/j.issn.1671-4040.2017.01.091