片仔癀肝宝对慢性肝损伤凋亡的影响*

赵锦燕 张毓宸 万芸 曾建伟 洪振丰#

（1福建中医药大学中西医结合研究院福州 350122；2福建省老年性疾病重点实验室福州 350122）

●论著●

片仔癀肝宝对慢性肝损伤凋亡的影响*

赵锦燕1,2张毓宸1,2万芸1,2曾建伟1,2洪振丰1,2#

（1福建中医药大学中西医结合研究院福州 350122；2福建省老年性疾病重点实验室福州 350122）

目的：探讨片仔癀肝宝（肝宝）对CCl4诱导大鼠慢性肝损伤凋亡的影响。方法：60只SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、西利宾胺组、肝宝低剂量组、肝宝中剂量组、肝宝高剂量组，每组10只。除正常对照组外，SD大鼠腹腔注射50%CCl4橄榄油溶液1 m l/kg，2次/周，连续8周。于造模第四周开始给药，设正常对照组（生理盐水）、模型组（生理盐水）、阳性药对照组（西利宾胺，50 mg/kg），肝宝低剂量组（150 mg/kg）、肝宝中剂量组（300 mg/kg）、肝宝高剂量组（600 mg/kg），1次/d，连续4周。于末次给药24 h后，HE染色观察肝宝对肝组织病理学的影响，TUNEL法观察肝组织凋亡情况，比色法检测Caspase-3和Caspase-9的变化，western blot检测肝宝对Bax和Bcl-2蛋白表达的影响。结果：HE染色发现，各用药组均可不同程度缓解CCl4诱导的肝损伤；肝宝抑制肝细胞凋亡；降低Caspase-3和Caspase-9的活力；下调Bax表达，上调Bcl-2表达。结论：片仔癀肝宝可以抑制CCl4诱导的肝细胞凋亡。

肝损伤；凋亡；片仔癀肝宝

片仔癀肝宝是一种由多种中草药混合而成的中成药制剂，由牛黄、田七、茵陈、龙胆草、栀子、大黄、白芍、甘草等多种名贵药材组成，具有较好的保肝护肝作用。本实验以四氯化碳（CCl4）诱导慢性肝损伤模型，用片仔癀肝宝进行干预治疗，观察片仔癀肝宝对慢性肝损伤的凋亡的影响，为临床应用提供实验依据。

1 材料

1.1 实验动物及饲养条件雄性SD大鼠，SPF级，体重（200±20）g，雄性，许可证号：SCXK（沪）2008-0016，由上海斯莱克实验动物有限公司提供。动物实验室，温度22℃，湿度65%，风速0.1～0.2 m/s，气流≥28次/m in。

1.2 实验药物及试剂片仔癀肝宝由福建省片仔癀药业股份有限公司提供；TUNEL试剂盒购自迈新生物技术有限公司；Caspase-3和Caspase-9试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；Bax、Bcl-2 和GAPDH抗体购自abcam公司；四氯化碳，分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司生产，批号：090209。

2 实验方法

2.1 动物分组、模型制备及给药雄性SD大鼠60只，随机分为六组（正常对照组、模型组、阳性药对照组，肝宝低剂量组、肝宝中剂量组、肝宝高剂量组），每组10只。正常对照组腹腔注射等体积橄榄油，其余各组腹腔注射50%CCl4橄榄油溶液1 m l/kg，2次/周，连续8周。于造模第四周开始给药，正常对照组（生理盐水）、模型组（生理盐水）、阳性药对照组（西利宾胺，50 mg/kg），肝宝低剂量组（150 mg/kg）、肝宝中剂量组（300 mg/kg）、肝宝高剂量组（600 mg/kg），0.5 m l/100 g体重，1次/d，连续4周。末次给药24 h后，空腹用2%戊巴比妥钠60 mg/kg腹腔注射麻醉后，腹主动脉采血，脱颈处死，剥离完整肝脏，称重，然后取右叶肝组织1 cm×1 cm×1 cm，用4%多聚甲醛（以pH 7.4的PBS配制）固定，用于组织形态学和TUNEL检测；取等量组织，用于分子生物学指标检测。

2.2 观察大鼠一般状态每天上午8:30左右，观察并记录大鼠的精神状态、行为、毛发光泽度、饮食、尿液、粪便以及死亡等情况。

2.3 肝组织病理学观察多聚甲醛固定的肝组织制备石蜡切片，HE染色，光镜下观察肝组织病理改变。

2.4 TUNEL法检测细胞凋亡按照TUNEL试剂盒说明书操作步骤及反应条件进行实验。高倍镜下观察肝细胞形态、标记强度及背景着色，低倍镜下用Image-pro plus获取图像并分析计数凋亡细胞阳性率及积分吸光度值。实验同时设阴性对照（无末端转移酶）及阳性对照（DNaseⅠ处理），每张切片随机选择10个视野拍摄分析，计数1 000个细胞。

2.5 比色法检测肝组织Caspase-3和Caspase-9的活力按照凯基生物公司Caspase-3和Caspase-9说明书进行。各取50 mg肝组织匀浆后加入裂解液提取总蛋白，取少量样品测定蛋白浓度。按试剂盒体系加入反应液，裂解液，待测样品和Caspase-3 （Caspase-9）底物，37℃孵育4 h，在酶标仪λ=405 nm处检测吸光度值，通过计算OD干预组/OD阴性组的倍数确定Caspase-3和Caspase-9的活化程度。

2.6 western blot法检测肝组织Bax、Bcl-2的蛋白表达取100 mg大鼠肝脏相同部位组织，每组加1 m l裂解液（含10 μl PMSF），冰上裂解30 m in。4℃、12 000 rpm离心10 m in，取上清。加入上样缓冲液，100℃加热10 min使蛋白变性。每孔上样8 μl总蛋白，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后用半干转仪器将蛋白转到PVDF膜上，电压15 V，时间30 m in。膜室温下用5%脱脂奶粉封闭3 h，膜洗清后加入一抗，一抗浓度以1∶200稀释后使用，4℃过夜。再分别加入与相应的二抗，室温放置1 h，ECL发光试剂盒显影，以GAPDH为内参，分析条带吸光度值。

2.7 统计学分析采用SPSS11.5统计软件分析，实验数据以 （±s）表示，多组均数间比较采用单因素方差分析检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 病理组织学结果肉眼观察正常对照组大鼠肝脏表面光滑，呈红褐色，轻按质软；模型组大鼠肝脏体积明显缩小，颜色黯淡，边缘钝，质硬，表面有大量纤维渗出物，与周围组织粘连明显；复方片仔癀肝宝各剂量组和阳性药对照组有效改善大鼠肝脏的颜色及质地，其中高剂量组变化明显。光镜下观察，可见正常对照组大鼠肝小叶结构正常，肝索排列整齐，结构清晰，未见肝细胞变性、淋巴细胞浸润及肝脏组织坏死等病理变化；模型组大部分肝小叶结构破坏，肝索排列紊乱，部分气球样变及空泡变性，严重者可见肝细胞坏死灶及炎性浸润；各用药组均明显改善了肝细胞气球样变及空泡变性，炎性浸润有效缓解，无明显组织坏死。见图1。

图1 片仔癀肝宝对肝脏病理组织学的影响（HE染色，×100）

3.2 复方片仔癀肝宝抑制CCl4诱导的细胞凋亡（1）TUNEL结果显示，模型组大鼠肝组织细胞核呈现明显棕褐色染色，表明CCl4诱导了肝细胞的凋亡，与对照组比较，具有统计学意义（P＜0.05）；西利宾胺和肝宝各剂量组均不同程度地抑制了阳性率的表达，与模型组比较，均具有统计学意义（P＜0.05）。见图2。（2）复方片仔癀肝宝对线粒体凋亡的影响：与对照组比较，模型组大鼠Caspase-9和Caspase-3表达上升，具有统计学意义（P＜0.05），西利宾胺和肝宝不同剂量组均抑制了Caspase-9和Caspase-3的表达。见图3。进一步研究发现，与对照组比较，模型组大鼠肝组织Bax表达上调，Bcl-2表达下调，肝宝高剂量显著抑制了Bax，上调了Bcl-2的表达。见图4。

图2 片仔癀肝宝对肝组织凋亡的影响（TUNEL，×400）

图3 片仔癀肝宝对Caspase-3和Caspase-9的影响

图4 片仔癀肝宝对Bax和Bcl-2蛋白表达的影响

4 讨论

CCl4是一种经典的化学毒物，利用CCl4制备的慢性肝损伤模型已广泛用于研究慢性肝损伤和肝纤维化的发病机制、血清标志物的研究及保肝药物的药效评价等[1]。本实验采用腹腔注射50%CCl4橄榄油溶液制备慢性肝损伤以观察片仔癀肝宝的药效及其可能机制。

正常情况下，凋亡被认为是维持肝脏生理平衡的有效机制，然而，在肝脏损伤的情况下，凋亡过度超过其自身的调节范围，凋亡就会成为加剧肝损伤的病理因素[2]。越来越多的研究发现，凋亡在肝损伤的发病中发挥重要作用[3～4]。本实验结果发现，CCl4腹腔注射可以促进肝细胞凋亡，片仔癀肝宝能有效缓解肝细胞凋亡情况。线粒体功能失调是凋亡的重要因素[5]，Caspase-3凋亡执行蛋白，实验结果显示，CCl4增加肝组织Caspase-3的表达；Bax和Bcl-2的比率失调一直被认为是线粒体凋亡途径的重要标志[6]，在本实验中发现，片仔癀肝宝可以调节Bax和Bcl-2的比率抑制凋亡的发生。综上所述，片仔癀肝宝可以改善慢性肝损伤大鼠肝组织的病理状况，说明片仔癀肝宝能有效预防慢性肝损伤,其机制可能与抑制肝细胞凋亡，促进肝细胞再生有关。

[1]吴丽,魏伟.肝纤维化的动物模型及治疗药物研究[J].中国药理学通报,2004,20(5):481-485

[2]Jaeschke H,Gujral JS,Bajt ML.Apoptosis and necrosis in liver disease [J].Liver Int,2004,24(2):85-89

[3]Higuchi H,Kurose I,Kato S,et al.Ethanol-induced apoptosis and oxidative stress in hepatocytes[J].Alcohol Clin Exp Res,1996,20(9): 340A-346A

[4]Bhattacharyya S,Ghosh S,Sil PC.Amelioration of aspirin induced oxidative impairment and apoptotic cell death by anovel antioxidant protein molecule isolated from the herb Phyllanthus niruri[J].Plos One,2014,9(2):e89026

[5]Hoek JB,Cahill A,Pastorino JG.A lcohol and m itochondria:a dysfunctional relationship[J].Gastroenterology,2002,122(7): 2049-2063

[6]Martinou JC,Youle RJ.M itochondria in apoptosis:Bcl-2 fam ily members and m itochondrial dynam ics[J].Dev Cell,2011,21(1): 92-101

Effect of Pianzaihuang Ganbao on the Apoptosis of Chronic Liver In jury

ZHAO Jin-yan1,2,ZHANG Yu-chen1,2,WAN Yun1,2,ZENG Jian-wei1,2,HONG Zhen-feng1,2#

(1The Institute of Traditional Chinese and Western Medicine,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou350122; 2Fujian Provincial Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Fuzhou350122)

Objective:To explore the effect of Pianzaihuang Ganbao(GB)on the apotosis of chronic liver injury induced by CCl4in rats.Methods:Sixty Sprague–Daw ley(SD)rats were random ly divided into control,model,silymarin,GB-low,GB-m iddle and GB-high groups,ten rats per group.Except the control group was received olive oil,the rest groups were intraperitoneally injected with CCl41 m l/kg,tw ice a week for 8 weeks constitutively.At the fourth week,the model and the control group were orally adm inistration physiological saline(PS),while the silymarin(50 mg/kg),GB-Low(150 mg/kg),GB-m iddle(300 mg/kg),GB-high(600 mg/kg)were orally administrated in treatment group respectively for 4 weeks.Twenty-four hours after the last treatment,HE staining was used to observe the histopathological change in liver;the apoptosis was determ ined by TUNEL assay;Caspase-3 and Caspase-9 were detected;the protein expression of Bax and Bcl-2 were determ ined by western blot.Results:The results from HE staining found that all treatment could alleviate the injuried liver tissues differently;GB could inhibit the apotosis and decrease the activity of Caspase-3 and Caspase-9; furthermore,down-regulated the expression of Bax and up-regulated Bcl-2.Conclusion:GB could inhibit the apotosis induced by CCl4.

Liver injury;Apotosis;Pianzaihuang Ganbao

R965

B

10.13638/j.issn.1671-4040.2017.01.001

2016-12-19）

陈可冀中西医结合发展基金（编号：CKJ2013015）

#通讯作者：洪振丰，E-mail：zfhong1953@163.com