PTPN22和转录因子FOXP3基因多态性与系统性红斑狼疮遗传易感性的关联性分析

李声东

[摘要] 目的 探讨蛋白酪氨酸磷酸酶22（PTPN22）和转录因子FOXP3基因多态性与系统性红斑狼疮（SLE）遗传易感性的关联性。 方法 选取2013年1～6月我院收治的系统性红斑狼疮患者80例为研究组，选取同期健康体检人员80例为对照组，对比两组研究对象的PTPN22和转录因子FOXP3基因多态性。 结果 FOXP3位点基因频率在两组研究对象当中的分布存在明显区别（P<0.05）；FOXP3基因-2383C/T同-3281C/A存在连锁不平衡，-2383T/-3281A的单倍型携带者明显加大SLE发病的风险（P<0.05）； PTPN22基因-1123G/C位点的等位基因以及基因型分布在两组研究对象之间无明显差异（P>0.05）。 结论 FOXP3基因-2383C/T的多态性同SLE发生发展之间存在显著的关联性，并且-2383T基因可能是该病重要的遗传易感基因，同时PTPN22基因位点1858C/1858T以及-1123G/C同SLE发病无明显关联性。

[关键词] PTPN22；转录因子FOXP3；基因多态性；系统性红斑狼疮；遗传易感性

[中图分类号] R593.241 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）05-0001-04

系统性红斑狼疮（SLE）属于免疫性疾病的一种，主要特点是免疫物沉积到皮肤、肾脏、神经系统以及血管当中，导致炎症以及坏死问题[1]。研究人员发现SLE患者的T细胞存在调节障碍并且合并有免疫功能方面的紊乱。这些免疫缺陷与患者T细胞功能以及数量方面的障碍存在联系[2]。FOXP3是T细胞的重要转录因子，在SLE的发生以及发展过程当中可能发挥重要影响。FOXP3基因在X染色体，分子生物学的研究结果显示FOXP3基因有着多态性，与多种免疫性疾病存在联系[3]。蛋白酪氨酸磷酸酶22（PTPN22）是近年来受到研究人员高度重视的免疫疾病基因，编码在T细胞传导途径当中，通过脱磷酸化作用影响T细胞的转导，从而抑制免疫性疾病出现[4]。本研究分析PTPN22以及FOXP3基因多态性与SLE之间的关系，从而为分析系统性红斑狼疮遗传易感性提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料

选取2013年1～6月我院收治的系统性红斑狼疮患者80例为研究组，男16例，女64例，年龄22～45岁，平均（35.1±2.6）岁，所有患者均符合美国风湿病协会的SLE诊断标准。选取同期健康体检人员80例为对照组，男18例，女62例，年龄23～44岁，平均（35.3±2.9）岁。两组患者的一般资料有可比性（P>0.05），本研究得到医院伦理委员会批准，患者知情同意。

1.2方法

1.2.1 PTPN22检验方法 采集患者的静脉血5 mL，EDTA抗凝之后，使用碘化钠法提取基因组DNA后保存备用。根据GenBank序列设计2对引物，特异性扩增FOXP3基因当中包含-3281C/3281A的DNA片段，取扩增产物2 L，37℃条件下孵育2 h，反应终止之后EB染色，染色之后使用凝胶成像判断结果[5]。

1.2.2 转录因子FOXP3检验方法 采集患者的静脉血5 mL，EDTA（乙二胺四乙酸二钠盐）抗凝之后使用蛋白酶抽提法提取DNA，使用DNA电泳法以及紫外分光法定量定性检测之后保存备用。电泳酶切反应1858C/1858T位点的基因扩增产物，消毒双蒸水2 h之后存储在37℃的水浴箱过夜，酶切后产物进行凝胶电泳分析，电泳之后将凝胶放到EB液当中染色1 h之后观察拍照[6]（封三图1）。

1.3统计学方法

读取个体样本之后计算基因型以及等位基因频率，确认是否符合平衡定律，对等位基因频率以及多态性位点的基因型频率进行检验[7]，数据用SPSS18.0软件分析，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1两组患者FOXP3基因多态性分布频率比较

FOXP3位点基因频率在两组研究对象当中的分布存在明显差异（P<0.05），见表1。

2.2两组患者FOXP3基因单倍型分布频率比较

FOXP3基因-2383C/T同-3281C/A存在连锁不平衡，-2383T/-3281A的单倍型携带者明显加大SLE发病的风险（P<0.05），见表2。

2.3兩组PTPN22基因启动子-1123G/CSNP位点的等位基因以及基因型分布频率比较

PTPN22基因启动子区域-1123G/CSNP在各组内男女之间三种基因型频率分布无明显差异（P>0.05），C等位基因的分布及CC基因型的频率在研究组和对照组之间分布也无明显差异（P>0.05），见表3。

3 讨论

系统性红斑狼疮是各种因素联合作用诱发的一种免疫功能失调疾病，当前情况下人们对该病的致病因素尚未完全明确，但是研究人员普遍认为细胞免疫功能在SLE的发病过程当中有不容忽视的影响。SLE患者的β细胞功能活化同时大量产生自身抗体，似乎SLE是β细胞异常诱发的疾病，不过β细胞的活化受T细胞异常的诱导与影响，因此SLE更像是T细胞介导的一种疾病[8]。FOXP3是foxhead的家族成员，在人体的CD4+以及CD25+T细胞当中都有表达，并且可以介导二者在胸腺当中的发育、功能维持以及外周表达[9]。相关研究的结果显示，FOXP3基因的突变或者是小鼠体内两种T细胞数量的减少，能够诱发比较严重的免疫性疾病[10]。当前FOXP3在SLE发病过程当中具体影响的研究还比较少见。有研究人员在小鼠的狼疮模型当中检测CD4+以及CD25+T细胞以及FOXP3表达，结果显示狼疮小鼠当中的CD4+以及CD25+T细胞表达要明显少于正常的小鼠[11]。还有研究人员发现在SLE患者的外周血细胞当中，FOXP3RNA水平明显下降。因此可以认为FOXP3在SLE发病过程当中可能会发生重要影响[12]。FOXP3的基因在X染色体的短臂，包括10个内含子以及11个外显子。研究显示FOXP3基因有着遗传多态性，这一特点给FOXP3基因表达以及转录带来直接的影响，从而在一定程度上决定着生物学功能，同部分自身免疫疾病存在密切联系[13]。因此有研究人员推测FOXP3的基因多态性同SLE的易患性存在联系[14]。在FOXP3基因的多态性以及SLE之间的关系方面，还缺乏系统深入的研究。为进一步分析FOXP3的基因多态性同该病发生发展的联系，本研究对比健康人群以及SLE患者，分析FOXP3的基因多态性，结果表明SLE患者的-2383C/T在多态性分布方面同健康人员比较而言有明显差异，T等位基因的携带频率在SLE患者当中要明显多于健康人群（P<0.05）。联合基因型分析结果显示发现，-2383T/-3281A的等位基因明显加大了SLE的发病风险。这意味着FOXP3基因的-2383C/T多态性同该病的发作有明显关联性，并且-2383T等位基因推测是SLE患者的遗传易感基因。FOXP3基因当中的-3281C/A多态性同SLE的发生发展无明显相关性。

PTPN22在1号染色体当中，共有15个内含子以及16个外显子，编码酪氨酸磷酸酶（LYP）[15]。LYP集中分布在人体的淋巴细胞当中，由含有脯氨酸基序（C端）以及磷酸酶区域（N端）组成。在T细胞的活化步骤当中，借助于C端名为P1的氨酸基序同Csk结构相连接而发挥调节功能，使得磷酸化的酪氨酸激酶能够脱磷酸化从而丧失活性，抑制T细胞信号通路的激活，通过这样的途径调节T细胞信号[16]。单核苷酸的变异会导致信号转导出现障碍，从而诱发免疫性疾病的出现以及恶化。相关研究的结果表明，截止到目前为止，亚洲地区还灭有出现基因位点出现变异的状况[17]。虽然该位点的研究数量比较多，不过主要为国外研究结果，同时实验的对象也主要是欧美白种人。当前国内研究人员在这一位点的研究大部分都同免疫甲状腺炎先关，同SLE有联系的研究比较少[18]。为进一步分析这一位点同SLE发病之间的联系，本研究选取SLE患者行了研究，结果并未检测患者当中存在T等位基因的变异。除此之外，我国其他研究人员的相关实验结果显示，CT基因型仅仅存在于锡伯族、蒙古族、赫哲族、回族、哈萨克族以及维族等少数民族当中[19]。本研究当中，我们研究基因启动子区域的-1123G/C位点同SLE发病之间的联系，结果表明该位点的3种基因型具体分布方面，研究组SLE患者以及对照组健康人群之间差异无统计学意义（P>0.05），两组患者当中C等位基因频率也没有显著差异（P>0.05）。因此可以认为该位点多态性同SLE发病之间不存在相关性。

在PTPN22的基因多态性同狼疮性肾炎之间的关系方面，狼疮性肾炎可以说是SLE的常见并发症之一，發病同多种基因存在联系[20]。研究人员根据是否存在狼疮性肾炎分组研究例西班牙的SLE患者，结果并未发现PTPN22在不同患者之间的明显区别，因此认为PTPN22的多态性对狼疮性肾炎并无直接的影响，推测是因为自身免疫疾病发生的基因基础比较复杂，PTPN22出现只是基因变异比较微弱的组成部分[21]。PTPN22的基因多态性同自身抗体之间的关系方面，有研究人员认为在多发性硬化以及其他自身免疫疾病当中缺乏明确的证据，推测该基因在抗体产生过程当中有重要的影响[22]。当前已知存在三种不同的自身免疫疾病抗体同PTPN22有明确的联系，例如I型糖尿病患者的抗谷氨酸抗体、RA患者的抗心磷脂抗体以及RF患者的自身抗体，推测PTPN22的变异借助于易化疾病抗体而导致患者出现自身免疫疾病。

国内研究人员采取同本研究类似的方法，研究自身免疫性的甲状腺患者，分析患者的位点情况，结果显示该位点在等位基因以及基因型的分布频率方面，同健康人对比存在明显差异，因此认为PTPN22启动子-1123G/C位点的多态性同免疫性甲状腺的发生发展存在重要的联系，并且同CTLA-4基因G等位基因存在互相协同的效果[23]。当前情况下，人们还不确定-1123G/C对于功能异常的影响，有人分析该位点附近的DNA序列，结果显示-1123G同转录因子激活蛋白4的结合位点较为匹配。其中后者属于螺旋-环-拉链家族。-1123G/C在激活蛋白4序列当中的中心位置，-1123C基因无法同已知的各种转录因子实现结合[24]。所以PTPN22当中的-1123C会影响到转录的效率，使得患者发生自身免疫性的疾病，PTPN22的杂合优势同表达调节存在一定的联系[25]。本研究并未发现其SLE患者的发病同GC基因型的优势相关，推测可能同样本数量多少、不同疾病类型以及位点易感基因不同的影响因素相关，还需要后续的研究加以证实。

综上所述，FOXP3基因-2383C/T的多态性同SLE发生发展之间存在显著的关联性，并且-2383T基因可能是该病重要的遗传易感基因，同时PTPN22基因位点1858C/T以及-1123G/C同SLE发病无明显关联性。

[参考文献]

[1] 高辉，彭传梅，付晓野，等. 云南汉族人群Tim-3启动子区-1516G〉T位点多态性与系统性红斑狼疮关联性研究[J]. 检验医学与临床，2015，1（8）：1034-1036.

[2] 彭传梅，高辉，付晓野，等. 云南汉族人群Tim-1基因多态性与系统性红斑狼疮关联性研究[J]. 中国实验诊断学，2014，2（12）：1961-1965.

[3] Wakeland EK，Liu K，Graham RR，et al. Delineating the genetic basis of systemic lupus erythematosus[J]. Immunity，2015，2（15）：397-408.

[4] 卫斐然，张育. 系统性红斑狼疮（SLE）与TNIP1基因相关性的Meta分析[J]. 中华疾病控制杂志，2015，19（11）：1152-1157.

[5] 唐雪梅. 系统性红斑狼疮遗传学研究进展[J]. 中华实用儿科临床杂志，2016，31（21）：1601-1604.

[6] Cantor RM，Yuan J，Napier S，et al. Systemic lupus erythematosus genome scan：Support for linkage at 1q23， 2q33，16q12-13，and 17q21-23 and novel evidence at 3p24，10q23-24，13q32，and 18q22-23[J]. Arthritis Rheum，2014，1（50）：3203-3210.

[7] 李媛，李萍，陈华，等. HLA-DQB1基因多态性与中国汉族人群系统性红斑狼疮的相关性[J]. 标记免疫分析与临床，2015，22（1）：37-40.

[8] Tucci M，Barnes EV，Sobel ES，et al. Strong association of a functional polymorphism in the monocyte chemoattractant protein 1 promoter gene with lupus nephritis[J]. Arthritis Rheum 2014，2（50）：1842-1849.

[9] 温鹏飞，王晓松，张敏，等. IL-6基因单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮的相关性研究[J]. 中华疾病控制杂志，2014，18（4）：277-280.

[10] 章俊，马亚琼，邱敏姿，等. 中国汉族TMEM39A基因单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮的相关性[J]. 南方医科大学学报，2014，（4）：556-559.

[11] 叶莉霞，付朝伟，江峰，等. 锌指蛋白基因IKZF3多态性与中国长江以南汉族人群系统性红斑狼疮的病例对照研究[J]. 中华流行病学杂志，2016，37（7）：996-1002.

[12] Prokunina L，Alarcon-Riquelme M. The genetic basis of systemic lupus erythematosus-knowledge of today and thoughts for tomorrow[J]. Hum Mol Genet，2014，13（1）：143-148.

[13] 吴成将，袁秋然，莫益姣，等. CD40基因多态性及血清水平与系统性红斑狼疮发病机制的相关研究[J]. 中华皮肤科杂志，2016，49（1）：12-16.

[14] 崔晓丽，李红梅，刘水和，等. IRF2基因rs13146124位点多态性与系统性红斑狼疮的关联性研究[J]. 重庆医学，2016，45（30）：4230-4232.

[15] Siminovitch KA. PTPN22 and autoimmune disease[J]. Nat Genet，2014，3（6）：1248-1249.

[16] 汤珣，束双双，王悦，等. 跨膜蛋白39A基因单核苷酸多态性与中国南方汉族人群系统性红斑狼疮相关性研究[J]. 中国现代医学杂志，2015，25（30）：33-36.

[17] 温琦，吴美容，何颖芝，等. IKZF1基因与恶性肿瘤及系统性红斑狼疮的相关性研究进展[J]. 中国实验血液学杂志，2015，23（2）：591-595.

[18] 谷园园，邹延峰，徐建华，等. 中国人群中Hsp90AB1基因多态性和SLE发病的关联研究[J]. 安徽医科大学学报，2016，51（8）：1151-1155.

[19] Criswell LA，Pfeiffer KA，Lum RF，et al. Analysis of families in the multiple autoimmune disease genetics consortium（MADGC）collection：The PTPN22 620W allele associates with multiple autoimmune phenotypes[J]. Am J Hum Genet，2015，7（6）：561-571.

[20] 李媛，李萍，王立，等. IkB激酶β和DNA聚合酶β易感基因位点与中国汉族人群系统性红斑狼疮的相关性研究[J]. 中华风湿病学杂志，2015，19（5）：297-301.

[21] 陈杰，饶亚华，朱建华. 汉族人中MFG-E8基因的多态性与系统性红斑狼疮的关系[J].免疫学杂志，2015，1（11）：1009-1012.

[22] 郑朝晖，荣玉玺，吴振彪. 系统性红斑狼疮相关生物标志物的研究进展[J]. 细胞与分子免疫学杂志，2015，31（8）：1128-1132.

[23] Kyogoku C，Langefeld CD，Ortmann WA，et al. Genetic association of the R620W polymorphism of protein tyrosine phosphatase PTPN22 with human SLE[J]. Am J Hum Genet， 2014，7（5）：504-507

[24] 姚承佼，鐘晓武，黄翠平，等. DNA甲基转移酶基因多态性与自身免疫性疾病关系的研究进展[J]. 山东医药，2016，1（4）：91-93.

[25] 刘春丽，蔡辉. 系统性红斑狼疮患者的感染[J]. 中国免疫学杂志，2015，2（6）：852-854.

（收稿日期：2016-11-11）