茶红素分离及稳定性研究

李山，陈小强，滑金杰，李佳，董春旺，王银诚，江用文，袁海波*

1. 中国农业科学院茶叶研究所 国家茶产业工程技术研究中心，浙江 杭州 310008；2. 湖北工业大学，生物工程与食品学院，湖北 武汉 430068

茶红素分离及稳定性研究

李山1,2，陈小强2，滑金杰1，李佳1，董春旺1，王银诚1，江用文1，袁海波1*

1. 中国农业科学院茶叶研究所 国家茶产业工程技术研究中心，浙江 杭州 310008；2. 湖北工业大学，生物工程与食品学院，湖北 武汉 430068

采用茶汤有机试剂萃取分离，并分别经过反相 C18柱层析纯化，制备出乙酸乙酯层、正丁醇层和酸性正丁醇层三部分茶红素。根据紫外可见光波扫描计算出色价，并研究了茶红素在不同条件下的稳定性。结果表明，30%、50%和70%甲醇梯度洗脱，纯化后3类茶红素液相检测发现无咖啡碱和茶黄素，仅有少量儿茶素杂质。纯化后色素色价分别为乙酸乙酯层128.04，正丁醇层91.04，酸性正丁醇层76.16。遮光处理，pH=3酸性条件，45℃以下贮藏，有利于茶红素的稳定性。

茶红素；柱层析；色价；稳定性

茶红素（Thearubigins）最先由 Roberts等人所提出[1-3]，是红茶加工过程中形成的色素，由儿茶素经过一系列酶促氧化形成邻醌，进一步聚合形成。茶红素占红茶干茶含量6%～15%，占红茶多酚类物质总量70%左右[4]。而且茶红素是红茶汤色、滋味等品质评价的重要指标，是红茶“冷后浑”现象形成的重要因素[5]。随着科研水平地不断发展，一方面茶红素可作为天然色素，而天然色素取代人工合成色素将成为一种趋势，开发安全可靠的茶红素具有很重要的意义；另一方面很多生物学活性研究表明，茶红素有较好的抗氧化、抗致畸等药理活性[6]，这都使得茶红素具有广阔的发展应用前景。但由于茶红素分子量差异大且组分复杂，结构尚不明晰[7]。国内外对茶红素的基础研究鲜有报道，尤其分离纯化方面仍还采用有机溶剂萃取，并没有更深入的探究。本文对茶红素的分离制备，以及关于茶红素稳定性条件的初步探究，将为茶红素的进一步研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

CTC（Crushing tearing curling）红碎茶5#，购于云南滇红集团（2015年 8月）；三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、盐酸、无水甲醇、柠檬酸、磷酸氢二钠、无水乙醇、乙酸、乙腈、碳酸氢钠、草酸（分析纯），儿茶素标准品、咖啡碱标准品、茶黄素标准品购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

UV2550型紫外-可见分光光度计，日本岛津公司；DK-S26型恒温水浴锅，上海精宏设备有限公司；Sartorius BT 124s分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司；旋转蒸发仪，瑞士BUCHI公司；FTS-BTD真空冷冻干燥机，美国KINETIC公司；BSZ-40自动部分收集器，上海青浦沪西仪器厂；LC-20A高效液相色谱仪，日本岛津公司；CM3500d分光测色计，柯尼美能达投资有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 茶红素粗品制备

称取100 g CTC红碎茶，以料液比为1︰20加入2 000 mL去离子水在80℃温度下水浴浸提10 min，期间不时搅拌，到时过滤，收集茶汤。将茶汤在分液漏斗中用两倍茶汤体积的三氯甲烷萃取，除去咖啡碱、叶绿素等杂质[8-9]；再用等量茶汤体积的乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯层；剩余水层再经正丁醇萃取，收集正丁醇层；在剩余水层加入0.15 mol·L-1盐酸50 mL酸化，酸化后水层再经正丁醇萃取，收集酸性正丁醇层。将3部分有机萃取层旋转蒸发、冷冻干燥，制得3种茶红素粗品。

1.3.2 茶红素纯化研究

茶红素极性较大，现采用反相C18填料纯化茶红素。使用前先将反相 C18填料（ODS-A-HG）用甲醇浸泡24 h进行预处理，装于60 cm×45 mm玻璃层析柱[10]。分别称取3类茶红素粗品各1 g，溶解于10 mL甲醇中，湿法上样，随后采用体积分数为30%、50%和70%的甲醇水溶液依次梯度洗脱，各浓度用两倍柱床体积洗脱，洗脱速度2 mL·min-1，用自动部分收集器每10 mL收集洗脱液，待测。

1.3.3 茶红素纯度检测

因茶红素结构复杂，至今未有单体物质解析出[11-12]，纯度检测无标品对照。现将如1.3.2方法收集的所有洗脱液逐一上样HPLC检测，然后与咖啡碱、儿茶素和茶黄素等标准品HPLC图谱对照，除去含有非茶红素杂质的洗脱液，合并所需相同峰型洗脱液，旋转蒸发、冷冻干燥，分别制备3类纯化后的茶红素。

HPLC测定条件：紫外检测器；ODSZ-C18柱，5 µm，4.6 mm×250 mm；流动相A为2%乙酸，流动相B为乙腈，流速1.0 mL·min-1，进样量：10 µL；检测波长为 280 nm，柱温40℃；梯度洗脱：流动相B在16 min内由6.5%线性变化至 15%，16～25 min由 15%变化至25%，25～30 min，恢复至原始6.5%。

1.3.4 茶红素光谱特性研究及色价

分别准确称取3类茶红素0.5 g，用50%甲醇定容至50 mL，充分溶解，稀释至适当倍数，以50%甲醇作参比，于紫外分光光度计上200～500 nm范围扫描，测定其最大吸收峰。

根据其扫描光谱图计算纯化后茶红素色价，计算公式[14]：

其中：XXX为待测物的最大吸收波长；A为吸光值；m为样品质量；f为稀释倍数。

1.3.5 茶红素稳定性实验

分别准确称量3类茶红素0.5 g，用50%甲醇定容于 50 mL容量瓶中作为母液，分别在不同光照、温度和pH值条件下测定茶红素的稳定性。在Lab色差系中a值反映红绿程度，因茶红素色差与其纯度存在较好相关性[15]，评价指标采用茶红素保留率=AX/A0×100%（AX为测定值，A0为最初值）和Lab色差系a值[16-17]，两者共同说明茶红素稳定性，试验重复3次，求平均值。

不同光照对茶红素稳定性影响：取 1 mL母液定容至 50 mL比色管中，分别置于室内日光灯下照射和遮光阴暗处存放。在4 h后分别测定其吸光值和色差a值。

pH对茶红素稳定性影响：取1 mL母液分别用pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液定容至50 mL比色管中。放置4 h后分别测定其吸光值和色差a值。

温度对茶红素稳定性影响：取1 mL母液定容至50 mL比色管中，分别置于30、45、60、75、90℃水浴加热，并恒温4 h冷却至室温后分别测定其吸光值和色差a值。

2 结果与分析

2.1 茶红素粗品产率

茶汤有机溶剂萃取制备出 3种不同部分茶红素（表1），乙酸乙酯层、正丁醇层和酸性正丁醇层其产率（粗品占原茶叶干重的质量分数）分别为 0.98%、2.87%和 1.41%，其总产率为5.26%。有机溶剂萃取损耗较为严重，其原因可能是有机溶剂萃取不彻底，旋蒸冻干处理期间有损失。

2.2 茶红素纯化研究

本实验先采用体积分数为30%、50%、70%的甲醇依次梯度洗脱，以2 mL·min-1洗脱速度每 10 mL收集流分。图 1为乙酸乙酯层茶红素洗脱液，A、B、C依次为体积分数为30%、50%、70%的甲醇洗脱液，经HPLC分析后，再进行对比（儿茶素、咖啡碱标准品对照和茶黄素标准品对照见表2和图2）。研究发现，结果如图3-A所示，30%甲醇洗脱液为儿茶素、咖啡碱等杂质，可能还存在叶绿素等其他大分子类杂质；与50%甲醇洗脱液相比，70%甲醇洗脱液颜色较浅，其主要物质为茶黄素部分（图3-B），而50%甲醇洗脱液红色更深，对比分析可知，图1中A、B、C的3～6收集液均无咖啡碱、茶黄素，但仍含有少量儿茶素杂质。将3类茶红素采用此梯度洗脱，结果如图4，其中乙酸乙酯层中含有GA、C、EGCG和CG杂质，质量分数分别为3.13%，0.16%，1.46%和 0.57%；而正丁醇层和酸性正丁醇层中儿茶素杂质含量较少，其中正丁醇层中GA和C，质量分数为3.23%和0.31%；酸性正丁醇层中GA和C，质量分数为1.78%，0.27%。总体除杂效果较好，3类茶红素均无茶黄素、咖啡碱。最终收集50%甲醇洗脱的所需部分，合并收集相同峰型洗脱液，将洗脱液旋转蒸发、冷冻干燥制成3种纯化后茶红素。

表1 不同茶红素部分的产率Table 1 The yield of different thearubigin fractions

图1 乙酸乙酯部分茶红素纯化中不同浓度甲醇洗脱液Fig. 1 Different concentrations of methanol eluent in purification of thearubigins extracted by ethyl acetate

表2 儿茶素组分标样的HPLC保留时间Table 2 Retention time of catechin standard samples in HPLC chromatograph

图2 儿茶素组分和4种茶黄素单体混合标样的HPLC图谱Fig. 2 HPLC chromatograph of catechins standard samples and four mixed standard samples of theaflavins

图3 乙酸乙酯部分茶红素纯化中30%和70%甲醇洗脱液的HPLC图谱Fig. 3 HPLC chromatograph of 30% and 70% methanol eluant in purification of thearubigins extracted by ethyl acetate

图4 纯化后茶红素的HPLC图谱Fig. 4 HPLC chromatograph of ethyl thearubigins after purification

2.3 茶红素的光谱性质研究及色价计算

3部分茶红素溶液在 200～500 nm范围紫外扫描结果如图5所示，紫外区210 nm和270 nm处有较强吸收峰，而在380 nm处亦有较弱吸收峰，考虑280 nm处为苯环特征吸收，一般作为儿茶素检测波长，故选定272 nm为茶红素最大吸收波长。乙酸乙酯层、正丁醇层和酸性正丁醇层在 272 nm 处吸光值分别为3.201、2.276、1.904。经色价公式计算得，乙酸乙酯层色价为 128.04，正丁醇层色价为91.04，酸性正丁醇层色价为76.16。色价体现色素的显色能力，由此可知3类茶红素显色能力为乙酸乙酯层＞正丁醇层＞酸性正丁醇层。

图5 紫外可见吸收光谱图Fig. 5 UV-Vis absorption spectra

图6 光照对茶红素稳定性影响Fig. 6 Effect of light on the stability of thearubigins

2.4 茶红素稳定性实验研究

2.4.1 光照对茶红素稳定性影响

结果如图6所示，乙酸乙酯层、正丁醇层、酸性正丁醇层分别在光照和遮光处理下的保留率。本实验采用在272 nm茶红素最大吸收波长下检测，光照下其吸光值均有略微下降，其中乙酸乙酯层保留率下降幅度较大。色差a值变化如图7，乙酸乙酯层茶红素a值最高，正丁醇层其次，说明乙酸乙酯层相对偏红。而遮光条件下，其a值均有略微增大。说明遮光有利于茶红素的保留，能够提高其稳定性。综合保留率和色差可得出，遮光处理利于茶红素稳定性，光照对乙酸乙酯层茶红素影响程度最大，正丁醇层和酸性正丁醇层都有较好耐光性。所以茶红素应在暗处存放。

2.4.2 pH对茶红素稳定性影响

茶红素分别在pH为3～8的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液放置4 h后，其保留率变化情况如图8所示。在pH为3～8时，随着pH升高，其保留率逐渐下降，正丁醇层茶红素保留率最高，且pH为3～4和7～8段变化幅度较大。pH为8～10时，因为在强碱性环境中，茶红素发生褐变（图9），其吸光值异常增加。其原因可能是茶红素为酚性物质，遇碱发生氧化，导致茶红素的结构发生了破坏，而产生褐变；而在色差试验中（图10），3类茶红素溶液的色差a值均随pH值升高下降趋势，在pH值6～10时乙酸乙酯层a值下降最大。综合得出，茶红素在酸性条件稳定性较好，pH=3时最佳，而碱性会导致氧化褐变，不利于其稳定性。

图7 光照对茶红素稳定性的影响Fig. 7 Effect of light on the stability of thearubigins

图8 pH值对茶红素稳定性影响Fig. 8 Effect of pH value on the stability of thearubigins

图9 不同pH值条件的茶红素溶液Fig. 9 Thearubigins solution under different pH conditions

图10 pH值对茶红素稳定性影响Fig. 10 Effects of pH value on stability of chromatic aberration a value of thearubigins

图11 温度对茶红素稳定性影响Fig. 11 Effect of temperature on the stability of thearubigins

图12 不同温度条件的茶红素溶液Fig. 12 Thearubigins solution under differnt temperature conditions

2.4.3 温度对茶红素稳定性影响

所配置的 3类茶红素溶液分别置于 30、45、60、75、90℃水浴加热，并恒温4 h后冷却至室温。在30～75℃，随着温度的增加3类茶红素保留率均逐渐下降（图 11），乙酸乙酯层变化幅度达 3.38%，高于正丁醇层的2.24%和酸性正丁醇层的 2.16%。整体上，酸性正丁醇层保留率略高于乙酸乙酯层，而正丁醇层最低。在温度达到 90℃高温时，茶红素发生褐变（图12），其褐变程度相对于pH=10时较浅，茶红素溶液都呈褐色，吸光值异常增加，其原因是在高温条件下，茶红素发生氧化褐变（当达到 90℃，吸光值异常增大，至 4左右，可能已经聚合成茶褐素了，计算保留率已毫无意义，而且折换成保留率超过100%，所以90℃保留率结果未放在图11中）。在色差试验中，随着温度由30℃升至90℃，茶红素溶液的色差 a值均呈下降趋势（图 13），其中乙酸乙酯层 a值由 6.86下降至 3.12，变化幅度高于正丁醇层和酸性正丁醇层。由上可知，温度过高导致茶红素氧化褐变，不利于其稳定性，茶红素在 90℃结构被破坏，而在45～75℃下降幅度较为明显，选择低于45℃下贮藏为佳。

图13 温度对茶红素稳定性影响Fig. 13 Effect of temperature on the stability of thearubigins

3 小结与讨论

本文采用有机试剂萃取，将茶红素分为乙酸乙酯层、正丁醇层和酸性正丁醇层3类。然后应用反相 C18柱层析，采用体积分数为30%、50%、70%、100%的甲醇水溶液梯度洗脱，洗脱速度为 2 mL·min-1，纯化制备出 3类茶红素，研究发现洗脱效果较优，所制备的茶红素不含咖啡碱、茶黄素，仅含有较少类儿茶素杂质。该纯化后茶红素经紫外扫描，发现不同部分茶红素在 272 nm 处均有吸收峰，符合苯环类化合物吸收特征峰。并以色价公式计算得出，乙酸乙酯层为 128.04，正丁醇层为 91.04，酸性正丁醇层为 76.16，乙酸乙酯层色价最高，其显色能力最佳。通过以保留率和 Lab色差系 a值作为指标，探究茶红素在不同光照、pH值和温度条件下的稳定性。研究发现，遮光处理对茶红素贮藏更好；pH=3酸性条件下稳定性高，碱性条件下茶红素发生氧化褐变；温度在 60℃以下稳定性高，温度逐渐增加不利于其稳定性，90℃发生氧化褐变。褐变实质可能是茶红素本身由儿茶素酶促氧化聚合，保留酚羟基较多，而在高温碱性环境下，导致酚羟基类物质因氧化而结构破坏，从而导致褐变。

国内外对茶红素研究甚少，其结构复杂至今未被解析出。难点其一在于茶红素定量，Roberts提出的系统分析法仅能检测茶叶本身的茶红素含量，而茶红素粗提物的定量无法分析，仅能用把其他物质排出的方法来差量定性；其次是茶红素单体解析是迫切需要解决的难题，需要进一步利用 MALDI-TOF-MS、FT-ICR-MS等技术方法深入地进行结构解析，若解决则可极大推动分离纯化及相关的后续研究。总之，茶红素作为天然色素，还有其抗氧化、抗致畸性等生物学活性，应用前景非常广阔，是一种很值得开发的天然资源。

[1]Roberts EAH, Catright RA, Oldschool M. The phenolicsubstances of manufactured tea. I—Fractionation and paper chromatography of water soluble substances from manufactured tea [J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1957, 8(2): 72-80.

[2]Roberts EAH. The phenolic substances of manufacture tea.Ⅱ -Their origin as enzymic oxidation products in fermentation [J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1958, 9(4): 212-216.

[3]Ngure FM, Wanyoko JK, Mahungu SM, et al. Catechins depletion patterns in relation to theaflavin and thearubigins formation [J]. Food Chemistry, 2009, 115(1): 8-14.

[4]宛晓春. 茶叶生物化学[M]. 北京：中国农业出版社, 2003: 30-31.

[5]熊昌云, 彭远菊. 红茶色素与红茶品质关系及其生物学活性研究进展[J]. 茶业通报, 2006, 28(4): 155-157.

[6]李山, 吴周和, 吴正奇, 等. 茶红素的理化特性及生物学活性研究进展[J]. 食品与发酵工业, 2016(8): 273-278.

[7]Haslam E. Thoughts on thearubigins [J]. Phytochemistry, 2003, 64(1): 61-73.

[8]Brown AG, Eyton WB, Holmes A, et al. The identification of the thearubigins as polymeric proanthocyanidins [J]. Phytochemistry, 1969(12): 742-744.

[9]Rajesh K, Gmaru MGB. Isolation and analyses of polymeric polyphenol fractions from black tea [J]. Food Chemistry, 2006, 94(3): 331-340.

[10]王洋, 韩爽, 曹迪, 等. 反相 C18柱层析法制备高纯度辣椒碱单体[J]. 食品科学, 2013, 24: 65-68.

[11]刘千录. 影响红茶汤色的主要色素研究[D]. 北京: 中国农业科学院, 2015: 21-29.

[12]Kuhnert N. Unraveling the structure of the black tea thearubigins [J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2010, 501(1): 47-51.

[13]陈杰, 李进伟, 张连富. 紫甘薯色素的提取及稳定性研究[J]. 食品科学, 2011, 18: 154-158.

[14]Stodt UW, Stark J, Engelhardt UH. Comparison of three strategies for the isolation of black tea thearubigins with a focus on countercurrent chromatography [J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2015, 43: 160-168.

[15]陈小梅, 黄为民, 陈桂芳, 等. 栀子紫色素制备及其稳定性研究[J]. 中国食品添加剂, 2014(3): 120-124.

[16]Kuhnert N. Unraveling the structure of the black tea thearubigins [J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2010, 501(1): 47-51.

[17]Ozawa T, Kataoka M, Morikawa K, et al. Elucidation of the partial structure of polymeric thearubigins from black tea by chemical degradation [J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 1996, 60(12): 2023-2027.

Separation and Stability Analysis of Thearubigins

LI Shan1,2, CHEN Xiaoqiang2, HUA Jinjie1, LI Jia1, DONG Chunwang1, WANG Yincheng1, JIANG Yongwen1, YUAN Haibo1*

1. Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Engineering Research Center for Tea Processing, Hangzhou 310008, China; 2. School of Bioengineering and Food, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, China

In this study, thearubigins were extracted by organic extraction, and purified by reversed-phase C18column chromatography to obtain three types of thearubigins, namely ethyl acetate, n-butanol and acid n-butanol extracts. The stability of thearubigins under different conditions was analyzed by scanning UV-Vis absorption wavelength based on color difference. The results showed that there was no caffeine and theaflavins, but only a small amount of catechins were detected in the three kinds of thearubigins after 30%, 50% and 70% methanol gradient elution. The color values of thearubigins after purification were 128.04 for ethyl acetate extracts, 91.04 for n-butanol extracts and 76.16 for acidic n-butanol extracts. Shading treatment, pH=3 acidic conditions and temperature below 45℃will facilitate the stability of thearubigins.

thearubigins, chromatography, color values, stability

TS272.5+2；Q946.84+1

A

1000-369X（2017）02-201-10

2016-11-08

2017-02-16

国家茶叶产业技术体系红茶加工岗位（CARS-23）、中国农业科学院科技创新工程（CAAS-ASTIP-TRICAAS）、浙江省农产品化学与加工技术重点实验室/浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心（2016KF0012）

李山，男，硕士研究生，从事茶叶加工技术与品质化学方面的研究。*通讯作者：192168092@tricaas.com