高温对体外培养的兔视网膜色素上皮细胞的影响

杨冬萍 杨晓旭 俞洋

【摘要】目的：观察高温对体外培养的兔视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial cells，RPE）细胞的影响。方法：以体外培养的兔RPE细胞为研究对象，采用55℃水浴加热法对细胞进行不同时间（3、5、8min）加温处理，处理结束后立即进行CCK-8法检测细胞活性、流式细胞仪测定细胞凋亡、透射电镜观察细胞形态学变化。结果：55℃水浴各时间组OD值明显低于对照组，差异有统计学意义（P<005），且55℃水浴各时间组组间差异也均较显著（P<005）。对照组（37℃）细胞凋亡率为（592±087）%，55℃水浴3min组细胞凋亡率为（1328±061）%，55℃水浴5min组细胞凋亡率为（5082±372）%，55℃水浴8min组细胞凋亡率为（6490±059）%。与对照组比较，55℃水浴各时间组细胞凋亡率均明显增高，且组间差异具有统计学意义（P<005），在温度恒定的前提下，表现为随着水浴时间的延长，兔RPE细胞凋亡率越来越高。透射电镜能明显看到细胞凋亡形态的改变。结论：55℃水浴加热3、5、8min均可造成兔RPE细胞凋亡，水浴时间越长，细胞凋亡率越高。

【关键词】水浴加热；兔RPE细胞；细胞凋亡

【中图分类号】R44663【文献标志码】 A【文章編号】1007-8517（2017）07-0035-04

Effect of High Temperature on Cultured Rabbit Retinal Pigment Epithelium Cells

YANG Dongping1YANG Xiaoxu1YU Yang1，2*

1 Traditional Chinese Medical College of Ningxia Medical University， Yinchuan 750004， China

2 Key Laboratory of Ministry of Education to the Modernization of Hui Medicine Department， Yinchuan 740004，China

Abstract：Objective To observe the effect of high temperature on cultured rabbit retinal pigment epithelial cells Methods Rabbit retinal pigment epithelial cells were cultured in vitro by heating at 55 ℃ for 3 min， 5 min and 8 min The cell viability was measured by CCK-8 method immediately after the treatment，cell apoptosis was determined by flow cytometry，morphological changes of cells were observed by transmission electron microscopy（TEM）Results 55℃water bath OD value was significantly lower than the control group，the difference was statistically significant，and between 55℃ water bath each time group group differences was statistically significant difference （P<005）The control group （37℃） cell apoptosis rate was （592±087）%， 55℃ 3min group cell apoptosis rate was （1328±061）%， 55℃ 5min group cell apoptosis rate was （5082±372）%， 55 C 8min group cell apoptosis rate was （6490±059）% Compared with the control group， the apoptotic rate of the 55 ℃ water bath group was significantly higher than that of the control group （P<005） Under the constant temperature condition， with the prolongation of water bath time， Retinal pigment epithelial cell apoptosis rate is getting higher and higherTEM can clearly see the changes apoptotic morphologyConclusion The apoptosis of retinal pigment epithelial cells can be induced by heating at 55 ℃ for 3min， 5min and 8min， water bath time is longer， the higher the rate of cell apoptosis

Keywords：Water Bath； Retinal Pigment Epithelial Cells； Apoptosis

“凋亡（Apoptosis）”概念早在20世纪70年代初就由Kerr[1]等提出。随着生物化学及分子生物学技术的不断提高，国内外学者对有关细胞凋亡的探索已经深入到基因、分子水平。目前认为，细胞凋亡是由基因调控的、细胞主动有序死亡的一个过程，它主要参与机体内细胞数目的精准调节，以及机体的发育，细胞分化和维持内环境的稳定。一旦机体内外环境因素发生紊乱，便会引起细胞凋亡调节失衡，导致疾病的发生。研究发现，许多因素（如缺氧、激光照射、药物等）可诱导细胞发生凋亡，其中，激光作为一种新型光源，因其具有单色性强、发散角小、相干性好、能量高等优势，已被广泛应用于军事、医学、工业等各种领域[2]。眼底激光作为眼底病治疗的重要手段，应用甚广，激光与眼部组织发生作用时，以光热效应最为常见，光子在被生物组织吸收后，转化为热能，使局部组织温度上升，导致组织性质发生变化，即产生光热效应。Gabay等[3]认为光能主要被视网膜色素上皮吸收，少部分被脉络膜毛细血管吸收，其余则被脉络膜大血管吸收，或被巩膜散射，故热损伤常发生在视网膜色素上皮和局部脉络膜组织。因此，本研究以兔RPE细胞为研究对象，观察55℃水浴加热不同时间（3、5、8min）对细胞的影响。

1仪器与材料

11材料CCK-8试剂（日本同仁化学），Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（上海贝博生物有限公司），兔RPE细胞（赛齐（上海）生物工程有限公司）。

12仪器E680酶联免疫检测仪（BIO-RAD公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；电热恒温水浴锅（绍兴木可桥医疗器械厂）。

2方法

21兔RPE细胞的培养兔RPE细胞培养条件为：10% DMEM完全培养基（含100U/mL青霉素，100mg/L链霉素），于37℃、5%CO2培养箱中培养。

22细胞处理取若干瓶对数生长期的兔RPE细胞，弃旧培养液，温PBS洗涤2遍，025%胰蛋白酶消化约3min，镜下观察细胞回缩变圆、变亮，立即终止消化，用吸管吸取部分培养液，轻轻将细胞从瓶壁吹打下来，分别移入若干离心管中。

23实验分组①对照组，细胞不做任何处理；②55℃水浴3min组；③55℃水浴5min组；④55℃水浴8min组。

24CCK-8法测定细胞活性将加温处理的各管细胞接种于96孔板中，每孔100μL，再避光加入CCK-8试剂，继续孵育4h后，在酶标仪上测量其OD值。酶标仪的内置检测波长为450nm。

25Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡上述各组细胞于处理时间结束后，1000rpm，低速离心5min，弃上清；预冷PBS洗涤1次，轻轻混匀成单细胞悬液，1000rpm，5min离心后，弃上清，此步骤重复2次；将细胞悬浮于400μL Annexin-V结合液中，避光加入5μL FITC，4℃放置15min，上机前5min避光加10μL PI，在1h内完成流式细胞仪检测。

26透射电镜观察细胞凋亡收集对照组及各实验组细胞，2%戊二醛固定过夜（4℃），后进行常规的电镜脱水、包埋、双铅染色、超薄切片，透射电镜下观察细胞超微结构的改变。

27统计学分析数据运用SPSS170软件处理，以均数加减标准差（x[TX-*3]±s）表示，行t检验，P<005表示差异有统计学意义。

3结果与分析

31CCK-8法测定细胞活性55℃水浴各时间组OD值明显低于对照组，差异有统计学意义（P<005），且55℃水浴各时间组组间差异具有统计学意义（P<005）。

32Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡流式细胞仪检测将每组测试细胞区分成4个细胞亚群，分别为机械损伤或坏死细胞、正常活细胞、中晚期凋亡及继发性坏死细胞、早期凋亡细胞。这里主要分析早期凋亡细胞和中晚期凋亡以及继发性坏死两个指标。对兔RPE细胞进行55℃水浴加热3min、5min、8min后，对照组（37℃）细胞凋亡率为（592±087）%，55℃水浴3min组细胞凋亡率为（1328±061）%，55℃水浴5min组细胞凋亡率为（5082±372）%，55℃水浴8min组细胞凋亡率为（6490±059）%。与对照组比较，55℃水浴各时间组细胞凋亡率均明显增高，组间差异具有统计学意义（P<005），在温度恒定的前提下，表现为随着水浴时间的延长，兔RPE细胞凋亡率越来越高。见表1、图1。

33透射电镜观察细胞凋亡正常对照细胞呈圆形或椭圆形，细胞膜完整，胞浆内细胞器丰富，可见线粒体和粗面内质网等细胞器，胞质内有大量黑色素颗粒，核染色质分布均匀（图2）。而经过55℃水浴各时间处理过的细胞体积明显变小，胞质内细胞器变少或消失，有大量的空泡，核染色质聚集成团，边聚、分散，或裂解成碎片（图3）。

4讨论

细胞凋亡是指机体通过清除自身组织中无用的、有害的以及异常的细胞，以维持机体自身的稳定，是一种由基因调控的、细胞自主有序的死亡，是维护多细胞生物体内平衡的关键机制。细胞凋亡被认为是单个细胞的消亡过程，不引起炎症反应[4]。在许多视网膜疾病中，视网膜色素上皮细胞的凋亡起着重要的作用，研究证实，在眼病中，细胞死亡的最终途径是细胞凋亡的结果[5]。

本实验采用CCK-8法进行细胞活性检测、流式细胞仪测定细胞凋亡、透射电镜进行细胞形态学观察，主要探讨了55℃水浴加热不同时长（3、5、8min）对兔RPE细胞的影响。其中，CCK-8法细胞活性检测结果显示，55℃水浴各时间组OD值明显低于对照组，差异有统计学意义（P<005），且55℃水浴各时间组组间差异具有统计学意义（P<005）。流式细胞仪测定细胞凋亡结果显示，对照组（37℃）细胞凋亡率为（592±087）%，55℃水浴3min组细胞凋亡率为（1328±061）%，55℃水浴5min组细胞凋亡率为（5082±372）%，55℃水浴8min组细胞凋亡率为（6490±059）%。与对照组比较，55℃水浴各时间组细胞凋亡率均明显增高，且组间差异具有统计学意义（P<005），实验结果表明，55℃高温可诱导细胞细胞发生凋亡，这与文献相符[6-7]，且在一定的温度下，兔RPE细胞凋亡率与加温时间成正比。透射电镜结果显示：正常对照细胞呈圆形或椭圆形，细胞膜完整，胞浆内细胞器丰富，可见线粒体和粗面内质网等细胞器，胞质内有大量黑色素颗粒，核染色质分布均匀。经过55℃水浴各时间处理过的细胞体积明显变小，胞质内细胞器变少或消失，有大量的空泡，核染色質聚集成团，边聚、分散，或裂解成碎片。实验结果表明，高温可造成RPE细胞损伤，且以凋亡为主，而这种损伤与加热的温度和时间密切相关。

激光医学作为现代科技发展的一门新兴医学，其应用只有四十多年的历史，故中医在激光性视网膜损伤发病机理以及治疗作用方面报道甚少，但随着激光医学的快速发展，激光光热效应所造成的视网膜损伤已成为医学领域一个不可忽视的问题。岳红云等[8]发现，中药毓明方（羚羊角、枸杞、当归、白芍、川芎、防风、黄连、草决明等）可有效改善激光光凝治疗区视野视点的平均视阈值，对治疗性视网膜损伤具有一定的防治作用。其中，毓明方中羚羊角为君药，黄连、防风、草决明为佐药，傅仁宇[9]曰：“防风，黄连羚角，草决明散滞泻热，解结明目也，阴弱不能配阳之病，并宜服之”。激光作为一种高能量的单色光，可辨为热毒外邪，傅仁宇认为“六阳贼火上炎”为其发病机理，故治以“清心滋肾为先”。詹宇坚等[10]用具有健脾益气、活血化瘀的精明Ⅱ号丸治疗激光光凝兔视网膜病变，发现精明Ⅱ号丸可很好的促进视网膜色素上皮细胞和视细胞的修复。

目前，激光已广泛应用于工业、医疗等领域，随着激光暴露普遍化，激光眼损伤光热效应也受到越来越多的关注。如在传统光凝治疗中，眼组织温度一般升高40～60℃，导致视网膜全层损伤，并可累及到脉络膜[11]。因此，在利用激光的光热效应治疗眼部疾病时，必须严格监控视网膜温度和时间的变化，从而达到安全有效的治疗目的。对于从事激光工业的工作人员，须自觉加强自我保护意识，戴好防护眼镜和防护眼罩等，避免由激光光热效应引发的RPE细胞凋亡。

参考文献

[1]Kerr JFR，Wyllie AH，Currie AR.Apoptosis a basic biological phenomenon with ranging implications in tissue kinetics[J]. Br J Cancer，1972，26：239-257.

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[9]傅仁宇.审视瑶函[M].上海：上海科学技术出版社，1977：161.

[10] 詹宇堅，李景恒，余扬佳，等.精明Ⅱ号丸治疗激光光凝损伤兔视网膜的超微结构初步观察[J].中国中医眼科杂志，1994，4（4）：222-223.

[11] Mainster MA.Decreasing retinal photocoagulation damage： principles and technique[J].Semin Ophthalmol，1999，14（4）：200-209.

（收稿日期：2017-01-24编辑：程鹏飞）