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栀子对大鼠肠道菌群及血清细胞因子的影响

2017-04-22俞琦梁建东王平田维毅

中国民族民间医药·上半月 2017年4期
关键词:肠道菌群栀子细胞因子

俞琦++梁建东++王平+田维毅

【摘要】目的:观察栀子对大鼠肠道菌群和血清细胞因子的影响。方法:将40只大鼠随机分成正常对照组、抗生素对照组和栀子高/中/低剂量组,抗生素对照组和栀子高、中、低剂量组分别给予盐酸林可霉素和不同剂量栀子水提物灌胃,正常对照组代以生理盐水,连续 14d。观察各组大鼠一般情况,检测大鼠肠道双歧杆菌、乳酸杆菌、肠球菌和肠杆菌菌群数量,及血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、γ-干扰素(IFN-γ)表达水平。结果:与正常对照组比较,抗生素对照组和栀子中、高剂量组大鼠出现腹泻,体质量明显下降(P<001);抗生素对照组大鼠肠道内4种菌群数量均发生明显改变(P<005或P<001);栀子中、高剂量组大鼠肠杆菌菌群数明显降低(P<005或P<001),双歧杆菌、乳酸杆菌和肠球菌菌群无明显变化;栀子中剂量组大鼠血清TNF-α水平明显下降(P<005);栀子高剂量组大鼠血清TNF-α和IL-6水平明显降低(P<005或P<001)。结论:栀子对肠道菌群有一定影响,但不引起肠道菌群失调,栀子可下调血清TNF-α和IL-6水平,发挥免疫调节作用。

【关键词】栀子;大鼠;肠道菌群;细胞因子

【中图分类号】R2855【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517(2017)07-0029-03

中药栀子(Gardenia jasminoides Ellis)是茜草科植物栀子的干燥成熟果实,具有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒的功效,临床主要用于急性黄疸型肝炎、膀胱炎、目赤肿痛、上消化道出血等症[1]。栀子性味苦、寒,归心、肺、三焦经,为常见的苦寒药物。历代医药学家认为其苦寒碍胃,有耗气伤阴之弊。现代研究表明[2],苦寒中药可通过干预肠道菌群的种类、数量、比例、定位等生态因素,影响肠道代谢和免疫防御等功能。本研究拟建立不同剂量的栀子水提物灌胃模型,观察栀子对大鼠肠道中4种优势菌群和血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、γ-干扰素(IFN-γ)表达的影响,探讨苦寒药栀子对肠道生物学功能的调节作用,为其临床的合理使用提供科学依据。

1仪器与材料

11动物SPF级SD大鼠40只,雌雄各半,体重(200±20)g,购于重庆滕鑫生物技术有限公司,许可证号:SCXK-(军)2012-0011。

12材料栀子购于北京同仁堂贵阳药店,经贵阳中医学院生药教研室鉴定为正品。盐酸林可霉素注射液(河南天方藥业有限公司,批号070120049),双歧杆菌BS培养基、MRS培养基、胆汁七叶苷叠氮钠琼脂(青岛海博生物技术有限公司),伊红美蓝琼脂(EMB培养基,杭州微生物试剂有限公司),大鼠TNF-α、IL-6和IFN-γ ELISA检测试剂盒(武汉博士德生物有限公司)。

13[JP2]仪器SW-CJ-1F超净工作台(苏州净化);厌氧培养袋(日本三菱);371型培养箱(美国Thermo公司);ELX800全自动酶标仪(美国BioTek公司);高速低温离心机 5804D(德国Eppendorf公司)。[JP]

2方法

21中药水提物的制备按照规范制剂要求,常规制备栀子水提液,调整浓度相当于生药2g/mL冷藏备用。

22动物分组及处理取40只大鼠随机分成正常对照组、抗生素对照组及栀子高、中、低剂量组,每组8只。栀子水提液以成年人(按60kg计算)常规用药剂量的等效剂量为中剂量,大剂量为中剂量 5倍,小剂量为中剂量的 1/5。即栀子高、中、低剂量组分别以75、15、03g/kg灌胃给药,抗生素对照组给予盐酸林可霉素灌胃[3],各组给药体积为2mL/只,正常对照组给予等体积生理盐水,每日1 次,连续 14d。

23一般情况观察观察和记录各组大鼠活动、饮食、排便情况,用药第1天、第7天、第14天称量各组大鼠体质量,记录大鼠体质量变化。

24主要菌群分析末次给药24h后,大鼠股静脉取血,4℃静置过夜,离心取上清,置于-20℃冰箱待测。参照文献[4],处死各组大鼠,剪开腹腔,无菌操作取盲肠内容物01g,[JP2]放入无菌试管内,加09mL生理盐水,均匀震荡15min,将震荡好的溶液进行10倍系列稀释至10-9,根据预实验结果选用合适的稀释度,分别接种于各种培养基中,双歧杆菌:BS培养基,37℃厌氧培养72 h;乳杆菌:MRS培养基,37℃厌氧培养48h;肠杆菌:EMB培养基,37℃培养48h;肠球菌:胆汁七叶苷叠氮钠琼脂,37℃培养48h。培养结束后计数菌落,根据稀释度换算每g粪便中的细菌数,结果以菌落形成单位/克(CFU/g)的对数表示,即lg CFU/g。[JP]

25血清细胞因子水平检测取冻存血清,采用ELISA法,测定TNF-α、IL-6和IFN-γ水平,操作步骤按试剂盒说明书进行。

26统计分析应用SPSS 190软件进行数据分析,数据以均数±标准差(x[TX-*3]±s)表示,组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,P<005表示差异有统计意义。

3结果

31栀子对大鼠一般情况的影响正常对照组和栀子低剂量组大鼠进食和饮水量正常,被毛光滑致密,无腹泻;栀子中剂量组大鼠进食量逐渐下降,活动减少,毛色光泽度降低,出现腹泻,排稀便。抗生素对照组和栀子高剂量组大鼠进食饮水明显减少,腹泻较重,畏寒倦怠,被毛凌乱无光泽。灌胃后,随时间延长各组大鼠体质量逐渐上升,但抗生素对照组、栀子高剂量组上升缓慢,且在用药后期呈现下降趋势。与正常对照组比较,用药第7 天,抗生素对照组和栀子高剂量组大鼠体质量显著降低(P<005);用药第14 天,抗生素对照组和栀子中、高剂量组大鼠体质量均明显下降(P<001)。

4讨论

苦寒药物是最常用的中药类别之一,在临床各科有着广泛应用。苦寒药大多有泻下之功,长期或大量使用容易导致腹部隐痛、腹胀、腹泻等症状。人和动物胃肠道定居着种类复杂和数量庞大的正常微生物群,它们与机体间形成了互利共生的关系,保持相对稳定的状态,并对机体的物质代谢和免疫防御起着重要作用。包括药物在内的某些因素导致正常菌群的数量和比例发生大幅度改变时即为菌群失调,常引起急慢性腹泻和免疫功能紊乱等表现[5]。栀子是临床常用的苦寒中药,为了探讨栀子对肠道微生态和机体免疫的影响,本研究观察了口服栀子水提物对大鼠4种优势肠道菌群和血清细胞因子表达的影响。

结果显示,栀子中、高剂量可引起大鼠腹泻、体质量减轻,提示连续服用较大剂量栀子具有明显的泻下作用。栀子低剂量对4种肠道优势菌群无影响,中、高剂量对大鼠肠道内肠杆菌有一定抑制作用,但不影响双歧杆菌、乳酸杆菌和肠球菌的数量,提示栀子的应用没有导致大鼠菌群失调,而是起到调节肠道菌群的作用。双歧杆菌和乳杆菌被认为是肠道的益生菌,可维持肠道的健康环境,并通过竞争性抑制阻碍致病菌的黏附与定植,其产生的有机酸等代谢产物还能抑制或杀死有害生物[6]。栀子保持双歧杆菌、乳杆菌菌群的相对稳定,提示该药对肠粘膜可能有重要的保护效应。

TNF-α、IL-6和IFN-γ是由多种免疫细胞分泌的炎性细胞因子,介导机体组织细胞的生长、分化和功能调控,调节机体免疫并引起炎症反应。罗霞等[7]、孙必强等[8]认为菌群失调与炎症因子的释放水平相关。研究显示,抗生素对照组大鼠血清TNF-α、IL-6和IFN-γ水平均显著升高,提示菌群失调可能与炎症反应的发生有关,与文献研究一致[7-8]。实验结果显示,栀子未導致明显菌群失调,但不同程度地抑制了大鼠血清中TNF-α和IL-6的释放,提示该药对机体细胞因子的释放具有不同程度的调节作用,其调节机制有待进一步研究。

参考文献

[1][JP3]傅春升,娄红祥,张学顺,等.栀子的化学成分与药理作用[J].国外医药·植物药分册,2004,19(4):152.[JP]

[2][JP3] 吴云,陈瑞,田维毅.苦寒中药对肠道菌群结构影响的研究进展[J].中国微生态学杂志,2015,27(2):235-239.[JP]

[3] 于莲,张灵芝,马淑霞,等.纳米山药多糖合生元结肠靶向微生态调节剂对菌群失调大鼠细胞因子和凋亡蛋白表达影响[J].中国新药杂志,2016,25(24):2871-2875.

[4] 林曦,谢晓煌,吴仕娇,等.甲嘎松汤对急性肝损伤小鼠肠道菌群及细胞因子的影响[J].中医药导报,2016,22(10):10-17.

[5] 祝司霞.肠道菌群失调与疾病[J].科技信息,2012(25):446.

[6] 王福颖.德氏乳杆菌微胶囊性能评价及对肠道菌群调节作用研究[D].哈尔滨: 黑龙江大学,2014.

[7] 罗霞,罗爽,郑彦懿,等.肠道菌群失调增加小鼠肠上皮内T淋巴细胞活化和促炎细胞因子分泌[J].细胞与分子免疫学杂志,2016,32(8):1031-1035.

[8]孙必强,周英,刘卫东,等.不同剂型七味白术散对肠道菌群失调小鼠肠黏膜和血清 TNF-α,IL-6的影响[J].中国实验方剂学杂志,2016,22(4):95-100.

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