仙茅多糖对巨噬细胞分泌几种活性因子的影响

王晓敏 宣锦 卢芳国++田维毅 杨娟��蔡琨

【摘要】目的：观察仙茅多糖对体外培养的巨噬细胞分泌几种活性因子的影响，以期探索仙茅多糖活化巨噬细胞的部分机制。方法：将仙茅多糖体外与RAW2647巨噬细胞共同培养36h，ELISA法检测细胞培养上清中TNF-α、IL-1的含量，Griess比色法检测培养上清中NO的含量。结果：与空白对照组比较，仙茅多糖高、中剂量组TNF-α、IL-1和NO等活性因子的水平明显升高（P<005或P<001），且与阳性对照组的调节趋势相似。结论：仙茅多糖刺激巨噬细胞分泌TNF-α、IL-1和NO等活性因子可能是其活化巨噬细胞的重要机制。

【关键词】仙茅多糖（COP）；巨噬细胞；活性因子；肿瘤坏死因子-α；一氧化氮；白介素-1

【中图分类号】R2855【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2017）07-0032-04

The Effect of Polysaccharide Extracted from Curculigo Orchioides Gaertn on Several Active Factors in RAW2647 Cells

WANG Xiaomin1XUAN Jin1LU Fangguo3TIAN Weiyi1YANG Juan2*CAI Kun1，3*

1.Guiyang college of traditional Chinese medicine，Guiyang 500025，China；2. Natural products chemistry，Chinese academy of sciences key laboratory of guizhou province，Guiyang 550002，China；3.Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China

Abstract：Objective To investigate the effect of Polysaccharide extracted from Curculigo Orchioides Gaertn（COP） on several active factors in RAW2647 cells and explore the partial mechanism of how COP activates macrophages.Methods Macrophages co-culture with COP for 36h in vitro. TNF-α and IL-1 production of the cells induced by COP were measured by ELISA.NO production in supernatant was measured by Griess reagent.Results Compared with normal control group，COP significantly increased TNF-α、IL-1和NO production （P<005 or P<001）in 12500 and 6250μg/mL COP groups.And its adjustment trend is similar with the LNT group.Conclusion The effect of COP on these active factors in RAW264.7 cells may be the most important mechanism of how it activates macrophages.

Keywords：COP；Macrophages； Active Factors；TNF-a； NO ；IL-1

研究表明，多數中药多糖类成分具有较好的免疫调节作用，且相对毒性较低，是开发免疫调节制剂的较好来源[1-6]。中药仙茅为石蒜科多年生草本植物仙茅（Curculigo orchioides Gaertn）根茎，具有补肾助阳、益精血、强筋骨、行血消肿等功效，主要用于肾阳不足、虚劳内伤等症[7]，是贵州苗族人民常用的一种药物。仙茅多糖（Curculigo orchioides Gaertn polysaccharide，COP）是从仙茅中经水提醇沉后得到，前期研究发现，COP具有调节免疫、抗氧化作用[8-9]，并观察到COP可以增强环磷酰胺所致的免疫低下小鼠模型的免疫功能，且对小鼠腹腔巨噬细胞的作用尤为显著，但机制尚不清楚。巨噬细胞作为机体重要的抗原提呈细胞，其分泌的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）、一氧化氮（NO）等活性因子，是巨噬细胞参与特异性免疫应答的重要物质基础[10-14]。为了研究COP对巨噬细胞功能的调节机制，研究主要观察COP对小鼠RAW2647巨噬细胞释放TNF-α、IL-1、NO等活性因子的影响。香菇多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老作用且具有组分单一、质量稳定、疗效好、毒副作用小等优点[15]，它具有激活巨噬细胞的能力，并且已经被广泛应用于国内外临床，故研究选取其为阳性对照药物。

1仪器与材料

[JP+1]11仪器USA3131水套式CO2培养箱（美国热电）；酶联免疫检测仪（美国热电）；离心机（德国）。[JP]

12材料Mouse TNF-α ELISA试剂盒（批号：DKW12-2720-096）、Mouse IL-1β ELISA试剂盒（DKW12-2012-096）购自北京达科为生物技术有限公司； NO检测试剂盒（批号：E03N0041，BLUEGENE）； Dulbeccos Modified Eagle Media（DMEM）培养液（批号，SH3002201HyClone）；胎牛血清FBS（批号：20150914，浙江天杭生物科技有限公司）、胰酶（批号：J140032，HyClone，）以及香菇多糖LNT（批号：C11N6Y5663，上海源叶生物科技有限公司）。

13实验细胞小鼠单核巨噬细胞细胞（RAW 2647细胞）购自中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库，编号为：KCB200603YJ。

14[JP3]实验药物仙茅多糖由贵州省中国科学院天然化学产物重点实验室提供，多糖含量≥50%。多糖溶于DMEM中配制成浓度为50000μg/mL的母液，滤菌后4℃保存，实验时用DMEM培养液稀释即得。[JP]

2方法

21细胞分组及处理参考文献方法[16]，选取对数生长期的RAW2647细胞并调浓度为106个/mL。接种至无菌96孔板中（100μL/well），总共21孔，随机分为COP高、中、低剂量实验组、阳性对照组和空白对照组，每个样本浓度设3个复孔。[JP3]待细胞贴壁后，吸弃上清，分别加入含COP（终浓度为12500、6250、3125μg/mL）的DMEM[JP]完全培养基；阳性对照组加入含香菇多糖的培养基（终浓度为6250μg/mL）；空白对照组加入等量的培养基，完成后置于37℃、5%的CO2细胞培养箱中孵育。

22指标检测细胞孵育36h后，收集细胞培养上清。严格按照鼠TNF-α/ IL-1细胞因子ELISA试剂盒操作说明分别检测培养上清中的TNF-α和IL-1含量；Griess比色法检测细胞上清中的NO水平，采用酶标仪于450nm处读数，最后根据标准曲线计算出各活性因子的含量。

23统计方法数据采用SPSS 190软件统计分析，用均数±标准差（x[TX-*3]±s）

表示，组间比较采用单因素方差分析法，P<005表示差异具有统计学意义。

3结果

在COP对巨噬细胞释放活性因子水平的影响中，与空白对照组比较：COP高剂量组TNF-α的分泌量明显升高（P<005）；COP高、中剂量组NO的分泌量明显升高（P<001）；COP高、中剂量组IL-1的分泌量明显升高（P<001）。与阳性对照组比较：COP高剂量组TNF-α较阳性对照组高，差异有统计学意义（P<005）；COP高、中剂量组均能提高巨噬细胞NO的分泌量，较阳性对照组差异有统计学意义（P<001）；COP各剂量组对巨噬细胞分泌IL-1的水平较阳性对照组差异无统计学意义（P<005）。

仙茅是药用植物，其根茎具有益精血、强筋骨的功效，并与其中的多糖类成分密切相关。前期研究发现，仙茅多糖具有调节免疫功能与促进巨噬细胞吞噬能力的作用，但机制不够清晰。本实验旨在探索其作用机理并为进一步的机制研究作好铺垫。

巨噬细胞在正常机体的免疫防御过程中扮演着重要的角色，参与机体抗感染、抗肿瘤、免疫调节等过程[17]，是机体非特异性免疫防御的关键环节，同时还是特异性免疫应答过程中的重要参与者[18]。TNF-α、NO和IL-1是巨噬细胞产生的活性因子，是巨噬细胞发挥吞噬、抗原提呈作用的重要介质。本实验结果显示，COP在终浓度3125～12500μg/mL作用于巨噬细胞均可影响TNF-α、NO和IL-1的分泌，且呈现较好的量效关系。

TNF-α主要由激活的单核/巨噬细胞产生，参与免疫应答、促进抗炎反应、促进树突状细胞成熟和T细胞的增殖和激活，而且TNF-α是迄今为止抗癌活性最强的因子，不仅能增强宿主免疫力还能诱导肿瘤细胞凋亡[19-23]。本實验结果显示，高剂量组COP刺激巨噬细胞产生的TNF-α明显升高（P<005），初步推测COP能够活化巨噬细胞分泌TNF-α来增强宿主免疫力，并发挥抗肿瘤效应。IL-1是活化巨噬细胞分泌的重要细胞因子，能促进B淋巴细胞分泌IL-12和增强NK细胞的杀伤功能，在体内外通过间接或直接的方式产生相关作用[4，12，20，24-25]。实验结果表明，高、中剂量组COP处理巨噬细胞后，培养上清中的IL-1出现显著性上升（P<001），所以COP可能是通过激活巨噬细胞释放IL-1来加强机体免疫应答反应的。巨噬细胞受刺激活化后产生的NO具有细胞毒作用，可杀伤肿瘤细胞同时也是炎症反应中的重要信使分子，既是炎症反应与免疫调节的效应因子，也是关键的调节因子[20，24，26]。高、中剂量组COP处理巨噬细胞后，培养上清中的NO出现显著性上升（P<001），依据结果推断，COP可刺激巨噬细胞产生活性物质NO来参与免疫调节和炎症反应。

[JP+1]本实验中，COP对这三种活性因子的促分泌作用存在不同的敏感性，这种差异性可能为其以后临床应用于不同适应症疗效提供一定的理论参考基础，且COP对巨噬细胞的调节趋势与香菇多糖组相似。表明COP可能是通过激活巨噬细胞并分泌TNF-α、NO和IL-1这三个活性因子来参与机体免疫调节过程的。但其具体机制尚不清楚。

[JP+1]综上，笔者认为COP的这种增强免疫低下小鼠巨噬细胞吞噬能力和促正常巨噬细胞TNF-α、NO和IL-1分泌的作用有助于巨噬细胞吞噬病原微生物或肿瘤凋亡细胞，也有助于机体对抗异物入侵和抗肿瘤。这些作用可能都是现代免疫学研究中机体免疫调节和防治肿瘤的药理学基础。

[JP]

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